稻瘟菌剪接体蛋白基因MU1A的生物功能研究

【摘要】由稻瘟菌（Magnaportheoryzae）侵染水稻引起的稻瘟病（riceblast）是水稻生产上的严重障碍。稻瘟病菌成功侵染水稻等寄主植物包括多个连续的过程：分生孢子萌发、芽管伸长、附着胞形成、侵染钉分化和侵染性菌丝扩展等。其中每一环节都直接或间接地由特定的基因控制。因此，深入的研究稻瘟病菌致病的分子调控机制，可以为培育抗病品种，制定持久控瘟策略提供理论指导。研究表明，mRNA前体的剪接过程在从单细胞酵母到高等哺乳动物的真核生物中普遍存在，参与调控多种生命活动。通过本实验室的前期研究发现，剪接相关因子与稻瘟菌毒性存在相关性，甚至是直接的毒性因子。剪接蛋白U1A作为组成小核糖体核蛋白U1SnRNP的特殊性蛋白之一，在mRNA前体的剪接，转录的起始，以及抑制多聚腺苷酸化等方面发挥重要作用，但其在稻瘟菌或其它病原真菌中的作用目前并不清楚。稻瘟菌MU1A基因（M.oryzaeU1A，MU1A）的缺失或突变可能导致稻瘟菌mRNA前体的非正常剪接，影响部分蛋白质的正常表达，进而影响稻瘟菌正常的生长代谢过程，最终可能会影响稻瘟菌的致病力。本研究以野生型稻瘟菌的剪接体蛋白MU1A为主要研究对象，构建了MU1A基因的敲除载体，敲除线性片段，RNA干扰载体，过量表达载体。分别用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对野生型稻瘟菌中MU1A基因进行敲除，得到了14个单交换转化子，一个双交换但非MU1A基因缺失转化子，但是，始终没有得到MU1A缺失突变体。推测MU1A基因可能为稻瘟菌生存所必需的功能基因，敲除MU1A基因会导致稻瘟菌死亡或者转化子体内存在某种未知的机制可以阻止MU1A基因双交换的发生。应用RNA干扰和超表达技术，本研究进一步对稻瘟菌致病菌株70-15（Wt70-15）的MU1A基因进行RNA干扰和超量表达，得到了系列的MU1A表达下调菌株（Knock-downStrain）和超量表达菌株（Over-expressionStrain）。选取一个表达量为野生型菌株的48%的99号转化子（Kd-99），一个表达量约为野生型菌株的4倍的10号转化子（Op-10），对MU1A进行生物学特性分析。正常培养条件下，Wt70-15，Kd-99以及Op-10的菌落生长形态及生长速度差异不显著，但是Kd-99菌株的分生孢子发生了畸变（73.3%）。有趣的是，逆境条件下（过氧化氢、刚果红、SDS胁迫），同Wt70-15菌株相比，Kd-99菌株对过氧化氢、刚果红、SDS表现出明显的抗性，Op-10菌株的抗性反而降低。初步判断，MU1A可能与菌体非正常（逆境）条件下的生长控制有关，因为对大多真菌而言，暂时停止生长（或休眠）是保持个体生存的通用方式。研究还就分生孢子的萌发、附着胞形成，以及对植物细胞侵染进行了比较。结果表明，尽管Kd-99菌株的畸变孢子可以萌发，甚至能够形成附着胞，但部分附着胞明显变小或者色素沉积较少，而且有些附着胞也不能侵入洋葱表皮细胞。由此，我们认为MU1A基因是稻瘟菌生命活动所必须，MU1A基因的表达降低使稻瘟菌菌丝体失去对逆境的敏感性，表型不可控的非正常生长；同时，MU1A基因影响稻瘟菌分生孢子的正常发育，从而影响对植物细胞的侵染过程，可能参与致病过程。
【作者】梁勋纳；
【导师】张世宏；
【作者基本信息】吉林大学，植物病理学，2014，硕士
【关键词】稻瘟菌；MU1A；基因敲除；RNA干扰；过量表达；

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