东北红豆杉细胞培养高效提取紫杉醇技术体系研究

【摘要】红豆杉中的抗癌活性成分紫杉醇能够有效抑制肿瘤细胞的增生和繁殖,对多种癌症的防治具有显著疗效,被世人誉为“植物黄金”。但红豆杉生长缓慢,且紫杉醇含量极低,无法满足日益增长的市场需求,由于东北红豆杉是国家的一级保护植物,当务之急就是在保护红豆杉资源的前提下,利用现代科技手段通过不同途径获得紫杉醇。细胞培养生产紫杉醇的方法具有诸多优势,使其越来越受到研究人员的青睐。经文献调研显示,国内外有相关报道,但大多数都是对基础理论的研究,对高效获取紫杉醇的应用技术研究报道偏少,尤其是趋于产业化的技术体系的构建至今仍是空白。因此,本文以东北红豆杉为原料,通过检测技术的优化、愈伤组织诱导、高产细胞株系筛选,建立细胞悬浮体系,并通过添加代谢调节因子提高细胞悬浮体系中的紫杉醇产量,初步构建“东北红豆杉细胞悬浮培养高效获取紫杉醇的技术体系”。为东北红豆杉生产紫杉醇的规模化、商业化、产业化奠定了良好的基础,对于长白山野生资源药用植物的合理开发与高效利用提供了技术支持,具有重要的现实意义与深远的社会影响。本文获得的研究结论如下：1.通过单因素试验与Box-Behnken试验设计对东北红豆杉中紫杉醇的超声波提取及其快速分离检测的研究表明：单因素试验的最佳提取溶剂为乙醇-二氯甲烷(1：1),料液比为1：50,超声时间为1h,超声功率为200W；TLC-紫外分光光度法分离检测紫杉醇的修正系数K为0.009152；多因素试验以液料比(X1)、超声时间(X2)、超声功率(X3)为自变量,紫杉醇提取量为因变量进行响应曲面分析,得到回归方程为：Y=127.78+3.86X1+6.06X2+1.65X3-3.68X12-8.23X22-5.95X32+0.57X1X2+2.05X1X3+1.80X2X3最佳提取工艺为料液比1：53.23mL/g,超声时间1.11h,超声功率207.88W,此时的紫杉醇提取量为130.576μg/g。2.东北红豆杉愈伤组织诱导和继代培养的研究表明：以东北红豆杉幼茎为外植体,添加NAA2mg/L+6-BA0.5mg/L的改良B5培养基诱导愈伤组织效果最佳：11天即出现愈伤组织,诱导率达到94.9%,鲜重增殖倍数为1.13；将愈伤组织附着于外植体上直接继代比剥离后单独继代的效果好,直接继代愈伤组织增殖多,褐化程度轻；使用7.5mg/L柠檬酸作为抗褐化剂可使继代的愈伤组织增殖2.36倍,并且消除褐化现象；连续继代8-9次可使愈伤组织鲜重增殖及紫杉醇含量达到稳定(最高值),继代8次后,愈伤组织鲜重增殖3.83倍,紫杉醇含量为227μg/g,比从植物中直接提取提高了73.85%。3.东北红豆杉高产细胞株系培育方法的筛选试验研究表明：条件培养和看护培养均可实现在较低的细胞密度下获得较高的植板率,根据细胞克隆的生长情况及适当的植板率,确定细胞浓度为3×102个/mL效果最好；悬浮培养12d的细胞作为克隆材料时,出现细胞克隆的时间最短,16d的细胞作为克隆材料时,植板率最高；稳定性试验分析结果显示,继代细胞系的增长率在固体培养基上比液体培养基中稳定,但紫杉醇含量均存在一定波动。4.东北红豆杉细胞悬浮培养高效诱导的试验研究表明：东北红豆杉悬浮细胞生长曲线呈“S”型,细胞鲜重在第24天时达到最大,为54.5g/L；通过添加7种调节因子进行细胞诱导,茉莉酸甲酯、水杨酸、苯丙氨酸及赤霉素对东北红豆杉悬浮细胞生长及产紫杉醇的影响较为明显；以该四种调节因子的浓度为自变量,悬浮细胞收获时细胞内紫杉醇总产量为因变量,进行二次通用旋转组合试验设计,得到回归方程(经α=0.10显著水平剔除不显著项)为：Y=4.32000-0.12000X1+0.06667X2+0.10000X3-0.03333X4-0.40667X12-0.32167X22-0.22167X32-0.57667X42+0.02500X1X3+0.01500X2X4代谢调节因子浓度的最佳组合为：茉莉酸甲酯100μmol/L,水杨酸20mg/L,苯丙氨酸400mg/L,赤霉素2mg/L,此时,细胞内紫杉醇总产量高达4.32mg/L悬浮细胞生长第7天加入调节因子得到的细胞内外紫杉醇总产量最高,为4.855mg/L,紫杉醇释放率为10.48%；红豆杉悬浮细胞生长体系中小剂量连续添加调节因子比一次性大剂量添加效果好,细胞鲜重和紫杉醇总产量分别提高6.08%和11.57%；悬浮细胞生长体系中,紫杉醇的合成代谢滞后于细胞的生长。
【作者】赵晶；
【导师】佟月英；王淑杰；
【作者基本信息】吉林大学，食品科学与工程，2014，硕士
【关键词】东北红豆杉；紫杉醇；TLC-紫外分光光度法；细胞培养；高效提取；诱导体系；

【参考文献】
[1]杨新梅.高定向热解石墨的铁磁有序机理研究[D].山东大学,2010.
[2]周叶.碳纳米管膜/赝电容自支撑电极材料[D].天津大学,2014.
[3]刘红.晋南中原官话汾河片平阳小片声韵文白异读探析[D].山西师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[4]高双云.Banach空间中有界线性算子束的广义预解式[D].扬州大学,应用数学,2011,硕士.
[5]胡可露.三相感应电动机无速度传感器控制策略的研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[6]王欣星.乡（镇）土地利用总体规划中基本农田的划定研究[D].西南大学,土地资源管理,2013,硕士.
[7]单宝钰.改进SVPWM供电技术的永磁同步电机控制研究[D].沈阳工业大学,电气工程,2013,硕士.
[8]李波,苏卓,冷成财,王胜法,罗笑南.基于混合梯度最小化Mumford-Shah模型的高维滤波算法[J].自动化学报,2014,12:2926-2935.
[9]陈昱,陈银蓉,马文博.湖北省工业用地集约利用综合评价——基于365家典型工业企业的问卷调查[J].自然资源学报,2013,01:73-80.
[10]乔亚敏.关于《全国健美操大众锻炼标准》1-3套成人规定动作的比较研究[D].内蒙古师范大学,体育（专业学位）,2013,硕士.
[11]辛云.蒽醌氨基酸化合物的合成[D].河北师范大学,有机化学,2004,硕士.
[12]赵艳青.基于Newmark算法的变质量动力吸振器仿真方法研究[D].长安大学,车辆工程,2014,硕士.
[13]邢天怡.美国量化宽松政策对我国利率期限结构的宏观传导效应研究[D].吉林大学,金融学,2014,硕士.
[14]荆振生.设计类大学生自主创业研究下的创新实践探索[D].湖北工业大学,工业设计工程（专业学位）,2014,硕士.
[15]雷凯.步进电机细分驱动技术的研究[D].苏州大学,光学,2003,硕士.
[16]王保庆.中国西部区域金融中心发展格局研究[D].陕西师范大学,国民经济学,2014,博士.
[17]张新.基于动态故障诊断的SRLV容错控制方法研究[D].哈尔滨工业大学,飞行器设计,2014,硕士.
[18]刘鑫龙.PWM整流器的参数辨识与控制策略研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[19]汪欣.论境外特殊目的公司对境内权益控制的监管[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[20]尚春艳.智能水位计的研究开发[D].河北工业大学,电机与电器,2004,硕士.
[21]刘辉.WB-DWI联合常规CT/MRI在恶性肿瘤全身转移中的应用价值[D].泰山医学院,影像医学与核医学,2012,硕士.
[22]陆睿.可变形体物理模拟与碰撞检测研究[D].复旦大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[23]孙慧洋.1.25Gbps光纤接收CMOS跨阻预放电路的设计[D].辽宁大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[24]王亚伟.贝叶斯网络学习及缺失数据下的统计推断[D].北京邮电大学,应用数学,2013,硕士.
[25]王伟娜.有机无机复混肥与化学缓释肥对氮素的缓释作用比较研究[D].南京农业大学,微生物学,2012,硕士.
[26]牛红雁.第三方物流企业成本核算与控制研究[D].北京交通大学,2014.
[27]魏杰.黑人/白人：对决、建构[D].河北师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[28]王哲.无人艇自动避碰策略的研究[D].大连海事大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[29]郭一沙.辣椒碱纳米结构脂质载体的制备及其特性考察[D].河北医科大学,药剂学,2013,硕士.
[30]卓尕机.汉藏语法比较与词汇翻译研究[D].西北民族大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[31]祁娜.产妇产后恢复与膳食结构相关性研究[D].中南林业科技大学,食品科学,2014,硕士.
[32]张宏志.湖南借母溪国家级自然保护区总体规划[D].中南林业科技大学,林业,2012,硕士.
[33]陈永富.基于多控制器多轴同步的造波机技术研究[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[34]郭平,宋宏文,张文坡,舒良树,高艳.辽河油田大民屯凹陷地震资料的成像技术[J].石油地球物理勘探,2006,01:62-66+122+126-127.
[35]黄碧晴.合法性与企业战略行为的互动关系研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2014,硕士.
[36]胡程华.哺乳动物细胞周期调控系统的建模与控制[D].南京大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[37]王昱.数字图书馆中的权限控制研究[J].中国科技信息,2005,04:39.
[38]王培龙.脑组织特异性血管生成抑制因子1（BAI1）在肾癌中的表达及临床相关性研究[D].兰州大学,泌尿外科学,2014,硕士.
[39]刘希.基于黎曼问题的界面追踪方法[D].南京航空航天大学,流体力学,2013,硕士.
[40]田轲.长春市青少年业余篮球俱乐部教学活动现状调查与发展对策研究[D].吉林大学,体育,2014,硕士.
[41]胡富陶,余红卫.基于磁性分子印迹胶体磁珠分离和GC-MS检测血清中脂联素[J].宁波大学学报(理工版),2015,02:103-107.
[42]刘霞.大学课堂教师角色定位与分析研究[D].华中师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[43]黄永明.滇东碳酸盐岩类出露地区的地震勘探工作[J].石油地球物理勘探,1978,03:49-58.
[44]许溶烈.特大城市要因地制宜地积极发展轨道交通[J].地铁与轻轨.1989(01)
[45]王长香.《粤风续九》研究[D].扬州大学,中国古典文献学,2011,硕士.
[46]蔡灿.《燕赵都市报》2011年-2013年时评版特征和问题分析[D].河北大学,新闻学,2014,硕士.
[47]周晓宇.动补式复合词的对外汉语教学研究[D].渤海大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[48]过志伟,梁亚伟,周宇.太钢热轧带钢厂加热炉区电控系统[J].冶金自动化,1996,02:15-18.
[49]钟文.蛇床子素调节脂肪肝大鼠脂肪组织和培养细胞内脂肪酸代谢的机制研究[D].苏州大学,药理学,2012,硕士.
[50]朱海宽.无线随钻系统短节数据传输技术研究[D].成都理工大学,通信与信息系统,2013,硕士.