非小细胞肺癌驱动突变及预后因素研究

【摘要】第一部分腺鳞癌驱动突变研究驱动突变能直接引发肿瘤,利用特异性抑制剂,关闭其信号传导,能阻断肿瘤的生长及转移。随着一系列驱动突变的发现,这一策略在非小细胞肺癌的治疗中取得了巨大成功。非小细胞肺癌中己知的驱动突变包括EGFR、KRAS、HER2、BRAF和ALK等。其在肺腺癌和鳞癌中已有大量研究,并直接推动了肺癌治疗理念向以分子分型为基础的个体化治疗模式转变。但是对于非小细胞肺癌中另外一个主要病理类型腺鳞癌的驱动突变情况了解还十分有限。腺鳞癌恶性程度高,进展快,患者预后差。鉴定肺腺鳞癌驱动突变谱及其临床病理特征,对指导这一肺癌人群选择合适的治疗方案具有重要价值。通过直接测序和荧光原位杂交技术(FISH),对76例腺鳞癌、646例腺癌和342例鳞癌中的EGFR、KRAS、BRAF、HER2和ALK等基因突变情况进行了检测。根据腺癌成分病理亚型,我们将腺鳞癌分为两个亚型：可清晰区分亚型和实体亚型。进而分析两种腺鳞癌亚型的驱动突变和临床病理学特征,并与腺癌进行对比分析。此外,通过显微切割技术研究13例可清晰区分亚型中腺癌和鳞癌成分基因突变情况。临床病理资料收集包括年龄、性别、吸烟史、病理分期、IASLC/ATS/ERS肺腺癌亚型和无复发生存及总生存。76例肺腺鳞癌中43例(56.6%)存在驱动突变,包括24例(31.6%)EGFR突变,8例(10.5%)KRAS突变、1例(1.3%)HER2突变、2例(2.6%)PI3KCA突变、2例(2.6%)AKT1突变、4例(5.3%ALK融合基因和3例(4%)RET融合基因。其中一例患者同时携带EGFR突变和PI3KCA突变。另外33例肿瘤未发现存在上述突变。腺鳞癌EGFR突变率高于鳞癌,低于腺癌,而KRAS、HER2、ALK和RET突变频率高于鳞癌,与腺癌的突变频率接近。进一步研究发现可清晰区分亚型腺鳞癌与低分化腺癌具有相似的驱动基因突变谱和临床病理特征,都存在相对较高的EGFR突变率。而实体亚型腺鳞癌主要见于男性及吸烟患者,ALK和RET融合基因比例高达30.4%,而EGFR突变率只有4.3%。研究结果显示大部分肺腺鳞癌都存在已知驱动突变,并很可能受益于相应的靶向治疗。故在治疗前对患者进行驱动基因突变检测,对选择合理的治疗方案具有指导意义。第二部分通过实时定量RT-PCR在非小细胞肺癌中筛选ALK和RET融合基因ALK,RET和ROS1基因重排/融合是约10%非小细胞肺癌的发生原因。荧光原位杂交技术(FISH)是目前诊断基因断裂/融合的标准方法。但这种方法缺点在于：操作复杂、耗时长、价格昂贵且需要专业的荧光显微镜及病理专科医生读取结果和诊断。全外显子表达谱和全转录组测序分析显示上述融合基因断裂点前的5’端基因表达水平非常低,而断裂点后的3’端激酶域表达明显增高,即出现基因断裂表达或不平衡表达现象。本研究利用这一特点,设计出了一种全新的快速准确诊断融合基因的方法。通过全外显子表达谱芯片获得81例肺腺癌全转录本中每个外显子的相对表达水平。直接测序检测654例非小细胞肺癌EGFR、KRAS、HER2和BRAF突变情况。通过实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测ALKmRNA5’端非激酶域和3’端激酶域相对表达水平。FISH检测ALK基因断裂情况,RT-PCR确认融合形式。同时应用免疫组织化学方法检测ALK融合阳性样本ALK蛋白表达水平。对于融合形式未知样本,利用5’末端cDNA’快速扩增技术(5’RACE)分析ALK3’端伙伴基因。进一步通过qRT-PCR在654例非小细胞肺癌中筛选RET融合基因。在81例肺腺癌中,全外显子表达谱分析显示只有4例ALK重排阳性样本出现ALK基因表达不平衡现象。在177例EGFR、KRAS、HER2和BRAF突变阴性非小细胞肺癌中,40例(22.6%)样本表现出明显的ALK基因不平衡表达现象,而其余137例(77.4%)肿瘤ALK基因未见明显的表达断裂现象。FISH证实40例ALK基因不平衡表达样本全部发生了ALK基因断裂,而其余137例样本均为FISH阴性。通过RT-PCR和5’RACE,我们发现一种新的KIF5B-ALK融合形式(E17；A20)和五种新的EML4-ALK融合形式,分别为E6a;A19、E6a/bins18;A20、E17bins39;A20、E10a/b,E13;A20和E17ins65;A20。利用qRT-PCR,我们在654例非小细胞肺癌中还成功鉴定出13例样本存在RET融合基因。本研究显示qRT-PCR是一种快速、简单和有效的筛查和诊断ALK融合基因方法,非常适合临床中及时筛选出可能受益于ALK抑制剂治疗的少数人群。而非小细胞肺癌中另外一个具有不平衡表达的RET融合基因,同样可以应用该方法进行快速诊断。第三部分非小细胞肺癌预后因素分析非小细胞肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一。研究哪些因素和患者预后有关,并对高危人群进行早期干预治疗,不仅能延长患者生命,还可能为开发新的靶向药物提供靶点。非小细胞肺癌中存在的EGFR、KRAS、HER2和ALK等驱动突变毙直接引发肿瘤,并影响患者治疗方案的选择。但这些突变是否能影响患者术后无复发生存及总生存还有一定的争议。肿瘤微环境是影响患者预后的重要因素之一。其包括多种间质细胞成分,其中巨噬细胞最为重要,又称为肿瘤相关巨噬细胞。目前在细胞和动物模型水平发现巨噬细胞几乎参与了肿瘤发生发展的全过程。但目前缺少一种从人实体瘤中分离纯化出巨噬细胞的有效方法,制约了其在人体真实作用机制的研究。对巨噬细胞通过分泌哪些因子参与肿瘤进展和转移认识也十分有限。通过RT-PCR、直接测序或FISH检测EGFR、KRAS、HER2和ALK的突变情况。利用无血清短期贴壁培养法从人非小细胞肺癌中获得肿瘤相关巨噬细胞。运用qRT-PCR检测巨噬细胞内CathepsinK、CathepsinS、MMP-9、uPA、VEGFA、PDGF-B、EGF、HGF和COX-2的mRNA相对表达水平。细胞划痕和侵袭实验评估肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞迁移和侵袭影响。通过Kaplan-Meier生存曲线比较不同驱动突变、巨噬细胞中不同因子表达水平对患者无疾病复发和总生存的影响。研究显示在246例肺腺癌中,EGFR、KRAS、HER2或ALK突变状态与患者无复发生存无明显相关性。通过比较Kaplan-Meier总生存曲线,发现患者性别、病理分期、肿瘤分化和EGFR突变状态均与总生存相关。60例肺腺鳞癌中,EGFR、KRAS或ALK突变状态和患者无复发生存和总生存均无显著相关性。通过无血清短期贴壁培养,我们从98例非小细胞肺癌中获得了肿瘤相关巨噬细胞样本,并发现其能高表达CathepsinK、MMP-9、uPA、VEGFA、PDGF-B、HGF和COX-2,其中MMP-9的表达和患者预后不良相关。EGFR、KRAS、HER2或ALK突变状态对预测非小细胞肺癌患者术后复发价值可能不大。无血清短期贴壁培养法是从非小细胞肺癌组织中分离纯化肿瘤相关巨噬细胞的一种有效方法。肿瘤相关巨噬细胞通过表达CathepsinK、MMP-9、uPA、VEGFA、PDGF-B、HGF和COX-2参与非小细胞肺癌的进展和转移,其中MMP-9的高表达可作为患者术后早期复发及预后不良的预测指标。
【作者】王瑞；
【导师】陈海泉；
【作者基本信息】复旦大学，肿瘤学，2013，博士
【关键词】肺腺鳞癌；基因突变；EGFR基因；非小细胞肺癌；ALK基因；RET基因；预后；巨噬细胞；

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