Skiv212通过与Clock和Bmal结合正向调控斑马鱼生物钟

【摘要】地球上大多数生物体呈现以大约24小时为周期的生物节律，它由生物体内源的生物钟产生并维持。生物钟对诸如体温、睡眠周期、代谢及激素分泌等多种基本的生理过程以及行为都具有调控作用。因此，对生物钟的分子机制及其调控网络进行研究，有助于解释人体正常的生理生化过程和行为，并且对防治由生物钟紊乱所引发的相关疾病具有十分重要的意义。作为重要的模式生物之一，斑马鱼是研究脊椎动物生物钟分子机制的理想模型。和小鼠与果蝇类似，斑马鱼生物钟机制是基于Clock:Bmal异二聚体和Per:Cry复合体的转录/翻译负反馈调节环路。除了这些核心生物钟基因之外，研究发现许多基因产物具备调节生物钟的功能。然而，其他调节因子如何在斑马鱼生物钟调控中发挥作用等重要问题尚缺乏深入研究。在粗链脉孢霉中，RNA解旋酶FRH与FRQ蛋白形成复合体FFC并且抑制WCC介导的转录激活作用。目前的研究表明FRH是粗链脉孢霉生物钟中重要的调节因子，但是其具体的调节机制则尚未完全阐明。通过系统树分析，我们发现斑马鱼skiv2l2与粗链脉孢霉frh属于同源基因。先前的研究表明该基因在斑马鱼幼鱼的黑色素细胞再生中起作用。然而，skiv2l2是否参与生物钟调控网络以及具体调控机制尚未有相关研究。本研究通过分子生物学和生物化学方法手段探讨skiv2l2在斑马鱼生物核心环路中的功能。荧光定量实时PCR显示skiv2l2的mRNA在斑马鱼幼体和成鱼肝脏中呈现明显的节律表达；此外，mRNA水平在bmal1b突变体中其表达下调，但在per1b突变体中上调。对skiv2l2的启动子进行序列分析发现，其启动子拥有E-box顺式元件；萤光素酶检验显示Clock1a:Bmalb异二聚体能够增强skiv2l2启动子的转录活性，而Cry1.1a则抑制其活性；染色质免疫沉淀实验发现Bmal1b能够结合skiv2l2启动子中的E-box顺式元件。这些结果表明生物钟直接调控skiv2l2的表达。尽管skiv2l2纯合突变体因鱼鳔缺陷难以运动，skiv2l2杂合子突变体则体态正常。行为检测发现skiv2l2杂合突变体游泳节律异常；核心钟基因per1a、per1b、per2、per3、cry1.1a、cry1.1b、cry1.2a、cry1.2b以及钟控基因annat2和pck1等在skiv2l2纯合子突变体表达降低。这些结果表明，skiv2l2在斑马鱼生物钟调控环路中起到不可或缺的作用。同时，体外细胞转染实验表明Skiv2l2的过表达能够激活Bmal1b:Clock1a介导的转录；免疫共沉淀实验表明Skiv2l2能够与Clock1a和Bmal1b结合，而不与Per2或Cry1.1a结合。综上所述，斑马鱼skiv2l2是一个新的钟控基因，其蛋白促进Clock1a和Bmal1b的转录活性。因此，skiv2l2是斑马鱼生物钟重要的调控元件。
【作者】谈毅城；
【导师】王晗；
【作者基本信息】苏州大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】生物钟；斑马鱼；skiv2l2；正向因子；Clock1a:Bmal1b异二聚体；

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