家蚕主要免疫信号通路对不同病原微生物的感染应答

【摘要】JAK/STAT、Toll、Imd和RNAi通路是与昆虫天然免疫的相关的主要信号通路，为探讨家蚕天然免疫相关通路对不同微生物的感染应答差异，本研究用大肠杆菌（E.coli），灵菌（Serratiamarcescens,Sm）、黑胸败血芽孢杆菌（Bacillusbombyseptieus,Bab）、白僵菌（Beauveriabassiana,Beb），家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕质型多角体病毒(BmCPV)、家蚕浓核病毒(BmDNV)以及家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,Nb)诱导，通过real-timePCR检测了Bmstat、Bmspz、BmPGRP-LB、BmPGRP-LE、Bmago2及Bmdrc2表达水平的变化，以期进一步分析家蚕的天然免疫机制；蚕类黄斑病毒（BmMLV）是一种能隐性感染家蚕及其培养细胞的病毒，为探讨BmMLV的隐性感染机制，本研究通过real-timePCR检测了Toll、Imd、JAK/STAT、RNAi四大信号通路对BmMLV感染的免疫应答。取得的主要结果如下：一、抑制SOCS表达对JAK/STAT通路的调节作用为探讨家蚕BmSOCS2以及BmSOCS6对JAK/STAT信号通路的调节作用，将BmSOCS2、BmSOCS6特异性的siRNA转染家蚕BmN培养细胞，检测沉默BmSOCS2、BmSOCS6基因对Bmstat表达水平的影响，结果显示，4种SOSC2的siRNA对BmSOCS2基因的沉默效果并不明显，引起Bmstat基因的表达水平变化也不明显；用socs6-48siRNA处理培养细胞，BmSOCS6基因的表达水平下降了1.78倍，而Bmstat的基因表达上升了11.55倍，推测SOCS6是家蚕JAK/STAT通路的负反馈调节基因。二、JAK/STAT通路对细菌、真菌、BmNPV的免疫应答为研究家蚕JAK/STAT信号通路对细菌、真菌的免疫应答，5龄3天家蚕分别注射灭活的E.coli、Sm以及Bab，6h后分别取实验组家蚕和对照组家蚕血液；4龄起蚕感染Beb，96h后分别取实验组家蚕和对照组家蚕血液；用real-timePCR检测样品中的Bmstat的转录水平。结果显示，家蚕感染不同细菌后，血液中Bmstat的转录水平没有明显变化，家蚕感染真菌后，血液中Bmstat的转录水平有明显变化，推测家蚕JAK/STAT信号通路对细菌的感染无应答，而对真菌的感染有应答。血细胞的免疫组化实验结果显示，感染BmNPV后，Bmstat表达水平提高，血细胞数目增加，且与STAT的表达偶联，推测血细胞的增殖、分化受JAK/STAT通路调节，BmNPV感染可激活JAK/STAT通路。三、Toll通路对不同微生物的免疫应答为探讨家蚕Toll信号通路对不同病原微生物的免疫应答差异，不同时期家蚕（大造）分别用不同的病原微生物诱导，通过real-timePCR检测Toll信号通路受体基因Bmspz的转录水平，结果显示，注射PBS造成机体损伤可上调Bmspz的转录水平；家蚕感染Beb、BmDNV后，Bmspz表达水平上调，而感染细菌、病毒（BmCPV、BmNPV）以及Nb后，Bmspz的表达水平没有明显上升，推测家蚕对抗真菌应答受到Toll信号通路调节，而对细菌、某些病毒以及微孢子虫的感染Toll通路无明显应答。四、Imd通路对不同微生物的免疫应答为探讨家蚕Imd信号通路对不同病原微生物的免疫应答差异，家蚕用不同微生物进行诱导，通过real-timePCR检测Imd信号通路受体基因BmPGRP-LB、BmPGRP-LE的转录水平。结果显示，注射PBS造成机体损伤能上调BmPGRP-LB的转录水平，家蚕注射G-菌E.coli和Sm，BmPGRP-LB的转录水平上调；家蚕感染白僵菌后，BmPGRP-LB的转录水平有所上调，家蚕感染病毒BmCPV、BmDNV、BmNPV后，BmPGRP-LB的转录水平有所上调，而家蚕感染Nb后，BmPGRP-LB的转录水平没有发生明显变化，感染Nb后，中肠中BmPGRP-LE的表达水平略有上升；家蚕感染G+菌Bab、G-菌Sm以及病毒BmDNV后，能上调BmPGRP-LE的转录水平，但在家蚕感染其他病原微生物时，并未发现BmPGRP-LE转录水平的明显变化。推测家蚕Imd信号通路主要负责调节G-细菌的应答，对BmCPV、BmDNV、BmNPV的感染应答可能通过间接方式激活Imd信号通路。五、RNAi通路对不同微生物的感染应答为了探讨RNAi信号通路对不同病原微生物的感染应答差异，家蚕用不同微生物进行诱导，通过real-timePCR检测RNAi信号通路中关键基因Bmago2、Bmdrc2的转录水平，结果显示，家蚕注射PBS后，Bmago2的表达水平无明显变化,Bmdrc2的表达水平有明显变化；家蚕感染不同病毒后，Bmago2的转录水平无明显变化，与对照一致。家蚕感染BmCPV、BmDNV后，Bmdrc2的转录水平无明显变化，与对照一致。感染BmNPV后，Bmdrc2的转录水平有明显变化。BmCPV和BmDNV感染并未能提升Bmago2、Bmdrc2的表达水平；注射E.coli后，Bmago2的转录水平无明显变化，但用灵菌Sm、黑胸败血芽孢杆菌Bab、白僵菌Beb、微孢子Nb诱导后，Bmago2的转录水平分别是对照的4.79、1.52、2.08和1.56倍。用E.coli、Sm、Bab、Nb、Beb诱导后，Bmdrc2的转录水平分别为对照的2.95、5.86、5.10、2.03、1.42倍，显示病毒感染没有能激活RNAi通路，部分细菌感染可激活RNAi通路。六、BmMLV感染复制与宿主(细胞)免疫应答家蚕类黄斑病毒（BmMLV）是一种能隐性感染家蚕及其培养细胞的病毒。BmMLV基因组为6.5kb的单链+RNA。为探讨BmMLV的隐性感染机制，本研究通过real-timePCR检测了Toll、Imd、JAK/STAT、RNAi四大信号通路对BmMLV感染的免疫应答。结果显示，家蚕感染BmMLV后，Bmstat、BmPGRP-LB、BmPGRP-LE、Bmago2、Bmdrc2的表达水平明显提高，表明JAK/STAT、Imd、RNAi信号通路对BmMLV的感染有应答作用，而Bmspz基因的表达无明显变化，推测Toll信号通路对BmMLV的感染无应答。Real-timePCR检测结果显示，BmMLV可隐性感染Sf9细胞，在哺乳动物细胞（293N）中有可能维持低水平增殖，在小鼠中低水平维持。细胞转染BmMLV的RNA及其全长cDNA克隆，可检测到病毒的增殖，证明BmMLV的RNA及其全长cDNA克隆具有侵染能力，但没有发现全长双链cDNA片段和全长单链cDNA片段有明显的感染性。37°C高温及在TC-100培养基中掺入哺乳类细胞培养液可促进病毒的增殖。
【作者】刘佳宾；
【导师】贡成良；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】家蚕；JAK/STAT通路；SOCS；Toll通路；Imd通路；RNAi通路；BmMLV；天然免疫；

【参考文献】
[1]毛家骏.话语中的移民歧视[D].天津商业大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[2]李玲.现代汉语通用量词研究[D].广西师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[3]童薇.5-12岁儿童反事实情绪的发展及影响因素[D].西南大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[4]杜玮璐.微博信息流扩散的时空特征研究[D].河北师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[5]施炜.PAR方法应用于管理信息系统开发方法的初步研究[D].江西师范大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[6]赵佳燕.基于中国制造业企业的国际化程度与经营绩效关系研究[D].浙江工业大学,国际贸易学,2012,硕士.
[7]常春艳.Parkin通过氧化应激途径保护DJ-1下调和DJ-1 L166P突变的SH-SY5Y细胞的线粒体稳态[D].复旦大学,遗传学,2012,博士.
[8]段林茂.移动IPv6下包过滤防火墙研究[D].太原理工大学,计算机应用,2004,硕士.
[9]MissWaranyaTraboon（百合）.华语电视台在泰国的发展及趋势研究[D].重庆工商大学,传播学,2014,硕士.
[10]王丽莉.基于MPLS的移动组播研究[D].南京邮电大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[11]郭立明.IL-10对脊髓损伤后ICAM-1表达的作用研究[D].青岛大学,外科学,2004,硕士.
[12]胡莎.数字时代的著作权合理使用制度研究[D].贵州民族大学,法律,2014,硕士.
[13]程晓明.十年间国际黄金价格波动研究[D].河北经贸大学,金融学,2014,硕士.
[14]高齐圣,耿金花,方爱丽,张嗣瀛.基于BA生长网络的产品市场演化分析[J].控制与决策,2007,05:554-557.
[15]孟昭波,冯英浚,范祯祥.地震仿真中的快速波场重建技术[J].石油地球物理勘探,1989,05:504-511+618.
[16]台连玉,肖洪群.B&WSMC型柴油机活塞断环原因及对策[J].航海技术.2005(03)
[17]王耀,叶小春,吴珂琪.伦敦城市轨道交通资产管理经验启示[J].交通运输系统工程与信息,2014,06:219-222+230.
[18]夏百卉.赏识教育理论与实践反思[D].东北师范大学,教育学原理,2012,硕士.
[19]张万鑫.红色和近红外长余辉材料的探索[D].广东工业大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[20]陈茹.基于多层次功能模型的软件回归测试技术研究[D].上海师范大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[21]朱鹏州.论代理授权行为的无因性[D].中国政法大学,比较法学,2014,硕士.
[22]胡建德,王光锷,陈乐寿,李维敏.大地电磁场二维正演计算中若干问题的讨论[J].石油地球物理勘探,1982,06:47-55+65.
[23]王慧丽.多溴代芳香二硝基化合物的合成与研究[D].青海师范大学,无机化学,2012,硕士.
[24]张宏宇.L-选择素在口腔鳞状细胞癌组织和涎腺恶性肿瘤组织中的表达及其相关性的研究[D].佳木斯大学,口腔医学（专业学位）,2014,硕士.
[25]凌能祥.回归函数基于分割估计及其改良估计的统计推断理论[D].合肥工业大学,应用数学,2004,硕士.
[26]王瑄.英国特色学校政策研究[D].首都师范大学,2004.
[27]商兰芳.政府公共财政支持的高等教育科研项目信息公开研究与思考[J].云南社会主义学院学报.
[28]汪洋.海上浮式风电基础设计方案及垂直轴风机性能分析[D].江苏科技大学,船舶与海洋工程,2014,硕士.
[29]杨霖,余加喜,郭志忠.基于过程状态特征化的电容器动态规划与控制[J].电力系统自动化,2008,19:40-44.
[30]于思杰.复方苦参止痒软膏（乳膏）治疗慢性湿疹的临床研究[D].北京中医药大学,中医外科学,2014,硕士.
[31]徐新.声发射技术在直升机部件疲劳裂纹检测中的应用研究[D].南京航空航天大学,测试计量技术及仪器,2003,硕士.
[32]刘艳萍.多孔银催化剂，铂/氧化铁基杂化结构催化剂的可控合成、表征及催化性能研究[D].西北大学,材料化学,2014,硕士.
[33]尤艳芳.温中益气胶囊药学及药效学研究[D].黑龙江中医药大学,方剂学,2014,硕士.
[34]田玉琼.现代汉语中的“在LV”与“V在L”结构及对外汉语教学策略研究[D].湖北大学,语言学及应用语言学,2012,硕士.
[35]王松林.渝东南地区残疾人体育事业发展调查研究[D].西南大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[36]余浩.H19/IGF2印记簇在骨骼肌发育中的调控机理初步研究[D].华中农业大学,动物遗传育种与繁殖,2014,硕士.
[37]杨琰.XX银行焦作分行中小企业信贷业务风险管理研究[D].郑州大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[38]张庆.食品卫生监督工作质量综合评价方法的研究[D].山西医科大学,卫生统计,2002,硕士.
[39]张霄霄.C/B/Cu-Al基自润滑材料的制备及其摩擦学性能的研究[D].中国矿业大学,2014.
[40]耿雪.从民当到官募：明代陕西驿夫研究[D].吉林大学,中国古代史,2013,硕士.
[41]李佳敏.政府采购的现状、问题与对策[D].浙江工商大学,行政管理,2013,硕士.
[42]富胜利.海明威“冰山理论”创作的研究[D].吉林大学,比较文学与世界文学,2004,硕士.
[43]高翔.Pro/ENGINEER三维技术在农业机械设计中的应用[J].中国农机化.2003(04)
[44]闫晓侠.高压脉冲电场下鱼骨中有效成分的半仿生提取及复合型饮品的研制[D].吉林大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[45]王洪全.新木152区块剩余油及挖潜技术研究[D].东北石油大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[46]姚永菲.现代汉语祈使功能问句习得研究[D].安徽大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[47]王锦.WDPF系统操作员站的扩展[J].冶金自动化,1996,04:47.
[48]于宇.微结构注射成型机螺杆的研究[D].北京化工大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[49]李旸.日本留学生习得汉语形容词重叠式的偏误研究[D].湖南师范大学,对外汉语,2013,硕士.
[50]王伟.基于小波变换的OFDM调制解调特性研究[D].哈尔滨理工大学,导航、制导与控制,2012,硕士.