miR-219通过抑制bmal1b调控斑马鱼生物钟

【摘要】地球自转导致了昼夜交替变化。从低等单细胞生物到高等动物人类，对这种昼夜循环的长期适应而演化出的记时机制即生物钟。生物钟是指大约24小时的周期性生理和行为变化，包括饮食、睡眠和体温等。经典的生物钟反馈环路为Clock和Bmal蛋白形成异二聚体，随后激活下游per和cry基因的表达，Per和Cry蛋白也形成异二聚体从而抑制Clock：Bmal蛋白复合物的活性。目前对于核心生物钟基因调控机制的研究主要集中在转录水平以及翻译后修饰，对于其在转录后水平的研究还知之甚少。MicroRNAs(miRNAs)是一类约22个碱基组成的非编码RNA，可以与靶基因的3’端非翻译区（3’UTR）结合从而影响信使RNA（mRNA）的稳定性或者抑制其翻译。miRNAs调节体内许多生物化学过程，这其中就包括生物钟。前人的一项研究发现小鼠的miR-219受生物钟调控，敲降miR-219导致小鼠运动周期加长，然而miR-219调控生物钟的机制仍然不明。斑马鱼拥有三个miR-219，分布在三个染色体上。我们采用原位杂交的方法发现斑马鱼的三个miR-219呈现不同图式的节律性表达。在体外细胞实验中，我们发现miR-219的启动子可以被Clock:Bmal蛋白复合物激活，同时被生物钟负向因子Cry所抑制。我们也构建了由miR-219-2启动子驱动的荧光素酶转基因鱼，证实了在体内miR-219-2也是表达振荡的。染色质免疫沉淀实验表明Bmal1b蛋白会结合到miR-219-2基因的启动子中的E-Box元件。在斑马鱼中过表达miR-219会导致bmal1b基因下调，进而抑制生物钟基因per2、per3、cry1.1a和cry1.2b的表达，但不影响bmal1a和bmal2以及per1a、per1b、cry1.1b和cry1.21的表达。体外bmal1b3’UTR靶点验证实验证明miR-219会直接结合到其3’UTR区域，靶位点突变实验也证明这种结合是特异性的。我们通过注射miR-219拮抗剂（antagomir）抑制体内miR-219的功能，行为实验表明相较与对照拮抗剂处理组，使用miR-219拮抗剂处理的斑马鱼活动量更高，而且bmal1b表达量也更高。相反，在松果体过表达miR-219会导致活动量下调。我们也利用CRISPR/Cas9系统制作了miR-219的斑马鱼突变体，为进一步研究其功能奠定了基础。本研究发现了miRNA-219受斑马鱼核心生物钟控制，同时又通过特异地抑制生物钟基因bmal1b的表达而参与生物钟调节，从而阐明了一种miRNA-219介导的新的负反馈生物钟调控机制。
【作者】陈锡峰；
【导师】王晗；
【作者基本信息】苏州大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】生物钟；miR-219；bmal1b；CRISPR/Cas9；突变体；

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