大鼠尺神经和肌皮神经再生时神经纤维代偿性放大规律的比较研究

【摘要】临床发现,尺神经重建手术效果不如肌皮神经,在供体神经纤维数量不足时更加明显。有研究发现,不同神经在供体神经纤维不足时,其神经纤维代偿性放大潜能不同。因此,我们假设尺神经纤维的放大潜能不如肌皮神经。本课题将通过研究尺、肌皮神经在其再生过程中神经代偿性放大效应差异及其影响因素,验证我们提出的假设,并根据实验结果从神经再生角度阐释尺神经重建手术不如肌皮神经的机制。实验分成三部分：(1)明确大鼠尺、肌皮神经在臂丛神经根的定量分布,其目的是采用稳定、可操作性强的方法,减少尺、肌皮神经中的神经纤维数量,从而建立可供研究尺、肌皮神经再生代偿性放大潜能差异的大鼠模型。(2)比较大鼠尺、肌皮神经再生时神经纤维代偿性放大极限。(3)通过Real-timePCR检测神经缝合口远端神经营养因子的表达,分析其表达量与神经纤维再生代偿性放大率的关系。第一部分建立研究尺、肌皮神经再生时神经纤维代偿性放大极限的大鼠模型目的通过True-Blue、Fluo-Emerald、Fluo-Ruby三种荧光剂逆行示踪,比较三种荧光剂染色的可靠性和稳定性。明确支配尺、肌皮神经的神经元在臂丛神经根的分布及支配比例,并采用切断某些神经根以减少尺、肌皮神经中的神经纤维数量,从而建立可供研究尺、肌皮神经再生代偿性放大潜能差异的大鼠模型。方法60只成年健康清洁级雌性SD大鼠,体重150-200克,随机分成6组,每组10只：U-TB组为尺神经True-Blue示踪组；U-FE组为尺神经Fluo-Emerald示踪组；U-FR组为尺神经Fluo-Ruby示踪组。M-TB组为肌皮神经True-Blue示踪组；M-FE组为肌皮神经Fluo-Emerald示踪组；M-FR组为肌皮神经Fluo-Ruby示踪组。分析支配尺神经和肌皮神经的神经元在脊髓的分布和各神经根支配比例,以及三种荧光剂染色定量结果的稳定性。每组数据以均数±标准差的形式表示,各组间的差异采用单因素方差分析,统计值设定为0.05。结果(1)U-TB组：显示着蓝色的神经元位于C7-T1脊髓前角和相应背根神经节,总数为2176±186.51。其中位于C7前角的数量为5.2±2.44个(0-9个),背根神经节内为31±11.32个；位于C8前角的数量为157±29.8个,背根神经节内为1203.1±113.71个；位于T1前角的数量为150±21个,背根神经节内为651.3±78.47。C5、6未见染色神经元。(2)U-FE组：显示着绿色的神经元位于C7-T1的脊髓前角和相应背根神经节,总数为2268.7±209.57。其中位于C7前角的数量为5.6±2.41个(0-8个),背根神经节内为34±7.73个；位于C8前角的数量为150±19.9个,背根神经节内为1305±194.8；位于T1前角的数量为142.4±±26.25.个,背根神经节内为631.2±±43.92个。C5、6未见染色神经元。(3)U-FR组：显示着红色神经元位于C6-T1节段脊髓前角和相应背根神经节,总数为2216±211.56。其中位于C6前角的数量为0个,背根神经节内为0-55个；位于C7前角的数量为4.4±2.22个(2～9个),背根神经节内为28.6±11.79；位于C8前角的数量为135±23.9,背根神经节内为1224.5±148.74.个；位于T1前角的数量为153.9±18.19,背根神经节内为669.7±97.42个。(4)M-TB组：显示着蓝色的神经元位于C4-C7的脊髓前角和相应背根神经节,总数为1871±120.53。其中位于C4前角的数量为0～11个,背根神经节内为7.8+4.05个；位于C5前角的数量为164±16.97个,背根内为253.3±36.96个；位于C6前角的数量为149±25.8个,背根神经节内为904.6±104.92；位于C7前角的数量为0-6个,背根神经节为386.5±28.77个。C8、T1脊髓节段未见染色神经元。(5)M-FE组：显示着绿色的神经元位于C5-C7的脊髓前角和相应背根神经节,总数为1937.9±311.22。其中位于C5前角的数量为171.2+49.31个,背根神经节内为244.4+25.49个；位于C6前角的数量为143±28.6个,背根神经节内为985.1±257.57；位于C7前角的数量为0-7个,背根神经节为291.7±51.36个。C4、C8、T1脊髓节段未见染色神经元。(6)M-FR组：显示着红色的神经元位于C4-C8的脊髓前角和相应背根神经节,总数为1902±212.64。其中位于C4前角的数量为0-12个,背根神经节内为0-15个；位于C5前角的数量为151.8±18.38个,背根神经节为240±30.4；位于C6前角的数量为132.7±16.64个,背根神经节为947±203个；位于C7前角的数量为0-15个,背根神经节内为412.6±±46.94个；位于C8前角的数量为0-2个,背根神经节内为0-4个。T1脊髓节段未见染色神经元。(7)本实验中,在三种不同荧光素染色标记的条件下,尺、肌皮神经在神经根及其背根神经节的分布及支配比例基本相同(P>0.05)。以Fulo-emerald示踪结果为基准,尺神经运动神经元主要位于C8和T1,两个节段数量基本相同,无统计学差异；感觉神经元主要位于C7、8和T1,C8节段数量最多。T1运动、感觉神经元总和约占支配尺神经的神经元总数的34.1%,C7占1.7,%,C8占约64.2%。肌皮神经运动神经元主要位于C5和C6,C5节段数量稍多；感觉神经元主要位于C5-7,C6节段数量最多,C7主要含感觉神经元。C5运动、感觉神经元总和占支配肌皮神经的神经元总数的22.1%,C6占62.5%,C7占15.4%。结论(1)采用切断C5-8神经根,保留T1神经根,并将尺神经切断后行自身端-端缝合修复的方法建立大鼠模型,作为以尺神经纤维代偿性放大极限的模型是可靠的。(2)采用切断C6-8、T1神经根,保留C5神经根,并将肌皮神经切断后行自身端-端缝合修复的方法建立大鼠模型,作为研究肌皮神经纤维代偿性放大极限的模型是可靠的。第二部分大鼠尺、肌皮神经再生时神经纤维代偿性放大极限的比较研究目的通过动态观察尺、肌皮神经神经再生过程中神经纤维代偿性放大率,比较这两神经的神经纤维放大极限。方法224只成年健康清洁级雌性SD大鼠,体重150-200克,随机分成神经放大模型16组,每组8只：U-1、2、3、4、8、12、16、20分别代表尺神经放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周；M-1、2、3、4、8、12、16、20分别代表肌皮神经放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周。以对侧肢体相应神经为正常对照组。切断相应神经,设为神经切断对照组,每组6只。按时间点检测(1)神经缝合口近、远端有髓神经纤维数量,计算其放大率；缝合口近、远端的运动纤维数量,计算其放大率；(2)神经CMAP波幅和潜伏期；(3)神经纤维直径、轴突直径、髓鞘厚度、G比率。每组数据以均数±标准差的形式表示,采用单因素方差分析分析各组间的差异,统计值设定为0.05。结果(1)正常肌皮神经、尺神经纤维总量分别为2135±197和2535±238；运动神经纤维分别为395±47和335±34。(2)尺神经放大模型建立后1周至4周,缝合口近端神经数量依次为653.23±102.71,703.79±84.26,772.40±54.93和593.41±39.36；缝合口远端神经纤维数量依次为979.72±162.73,972.35±93.30,1124.59±217.27和1980.33±216.53；放大率依次为2.20±0.53,1.41±0.24,1.57±0.39和3.34±0.51；建模后8、12、16和20周,缝合口近端神经纤维数量依次为725.92±132.93,671.80±112.25,553.52±64.71和682.51±107.42,远端神经纤维数量依次为2217.72±419.84,1677.29±254.92,1844.19±202.90和1953.13±412.17,放大率依次为3.01±0.44,2.76±0.37,3.15±0.46和2.31±0.98。(3)肌皮神经放大模型建立后1周至4周,缝合口近端神经数量依次为352.75±40.31,393.49±59.27,379.81±60.52和350.61±30.58；缝合口远端神经纤维数量依次为1079.75±242.41,477.36±83.55,453.75±76.59和1434.77+312.93,放大率依次为4.77±1.25,1.21±0.47,1.19±0.32和4.09±0.73；建模后8、12、16和20周,缝合口近端神经纤维数量依次为387.68±52.74,362.48±33.45,372.07±43.28和363.25±37.42,缝合口远端神经纤维数量依次1798.60±345.37,1566.19±217.04,1549.96±215.47和1479.31±174.58,放大率依次为4.71±1.32,4.29±0.79,4.23±0.65和4.34±0.49。(4)尺神经运动神经纤维：放大模型建立后1周至4周,缝合口近端运动纤维数量为212.61±43.82,192.43±27.55,200.92±35.27和183.90±27.44,远端为20.55±7.13,12.38±4.31,19.39±7.30和20.09±7.59,放大比率分别为0.094±0.031,0.057±0.012,0.110±0.031和0.102±0.037。8周、12周、16周和20周的近端运动纤维数量为190.37±25.38,222.61±42.73,208.52±74.75和231.45±77.19,远端分别为120.59±37.30,219.91±50.48,277.40±47.65和291.80±49.92,放大比率分别为0.72±0.169,1.06±0.242,1.48±0.45和1.45±0.317。(5)肌皮神经运动神经纤维：放大模型建立后1周至4周,缝合口近端运动纤维数量依次为235.41±32.70,229.74±61.53,202.72±55.09和199.61±28.78,缝合口远端的运动纤维数量分别为7.35±4.39,10.95±3.18,19.57±7.02和40.60±9.17,放大率依次为0.031±0.0184,0.045±0.0287,0.091±0.0221和0.195±0.049；建模后8、12、16和20周,缝合口近端运动纤维数量依次为254.10±47.75,218.06±27.80,231.44±30.40和230.51±40.06,缝合口的远端运动纤维数量依次为180.57±41.50,290.82±49.52,289.53±44.47和277.49±46.59,放大率依次为0.774±0.216,1.26±0.35,1.36±0.27和1.209±0.411。(6)20周时肌皮神经纤维直径为5.76±1.21μm,轴突直径为4.01±1.08μm,髓鞘厚度为0.72±0.24μm,G比率为0.73±0.12；尺神经纤维直径为4.28±0.84μm,轴突直径为3.14±0.11μm,髓鞘厚度为0.53±0.191μm,G比率为0.62±0.09。(7)正常尺、肌皮神经神经的CMAP的潜伏期分别为1.50±0.22ms和1.24±0.27ms。模型建立后的1-2周,未检测到尺、肌皮神经CMAP。正常尺神经的波幅为6.77±1.62mV；第3周开始,CMAP波峰逐渐增加。术后20周,波峰为4.14mV,小于正常对照组(P<0.05)。正常对照肌皮神经的波幅为9.46±2.33mV。3周时,波峰为1.32mV；第3周开始,CMAP波峰逐渐增加,至术后20周,波峰为7.97mV,与正常组相比有明显统计学差异(P<0.05)。20周时,尺神经CMAP波幅恢复率低于肌皮神经(P<0.05)。结论神经纤维代偿性放大模型建立后20周时,(1)尺神经运动神经纤维放大率与肌皮神经相似,两者无统计学差异P>0.05；(2)尺神经感觉纤维放大率小于肌皮神经。(3)20周时尺神经的神经纤维直径、轴突直径和髓鞘厚度均小于肌皮神经(P<0.05)。(4)20周时尺神经CMAP波幅、潜伏期恢复率低于肌皮神经(P<0.05)。第三部分尺、肌皮神经再生代偿性放大过程中远端神经的神经营养因子表达与感觉纤维放大率的关系目的分析神经纤维放大模型中,尺、肌皮神经缝合口远端BDNF.GDNF.CNTF和NGF的mRNA的动态表达与感觉纤维放大率的关系。方法224只成年健康清洁级雌性SD大鼠,体重150～200克。分成16组,每组8只。U-1、2、3、4、8、12、16、20分别代表尺神经放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周；M-1、2、3、4、8、12、16、20分别代表肌皮神经放大模型建立后1、2、3、4、8、12、16、20周。以对侧肢体相应神经作为正常对照。各组设立6只大鼠,切断相应神经,作为神经切断对照组。在术后的各时间点,分别取缝合口远端尺、肌皮神经,行Real-timePCR检测BDNF.GDNF.CNTF和NGF四种神经营养因子的]mRNA拷贝量,并比较其在尺、肌皮神经中的差异。结果(1)每组标本中,mRNA含量均在0.1μg/mg以上。其中U-1、U-2、U-3、U-4,以及M-1、M-2、M-3、M-4的总mRNA含量波动在0.38～0.46μg/mg,多于正常对照组的1mRNA含量(P<0.0001)。术后8周及更长时间组,各组总mRNA含量与正常组无统计学差异(P>0.05)。(2)尺神经纤维代偿性放大模型组：①NGFmRNA:术后1、3、4周,神经放大组、神经切断组表达量均高于正常对照组,而前两者之间无差异。4周以后的其余时间点,各组之间无明显统计学差异。各个组mRNA拷贝量均随着手术后时间的推移而逐渐下降.②BDNFmRNA:在正常对照组,未检测至BDNFmRNA；在神经放大组,随着时间推移,其拷贝量上升,3周时达到顶峰,之后逐渐下降,4周以后急剧下降,20周时检测到低度表达。神经切断组改变类似于神经放大组,但是处在一个更高的表达水平,在12周时较8周时轻微上升。③CNTFmRNA:在正常对照组各时间段均高度表达。神经放大组在术后1周即出现明显下降,以后其拷贝量逐渐上升,在术后的20周达到顶峰,但低于正常对照组水平。神经切断组在术后1周,其值亦明显下降,表达量稳定。4周以后,神经放大组CNTFmRNA的拷贝量多于神经切断组(P<0.05).④GDNFmRNA:在正常对照组,基本未检测至GDNFmRNA表达。在神经切断组,其拷贝量1到3周表达稳定,4周之后急剧下降。神经放大组1到3周内表达亦较稳定,但表达水平低于神经切断组；8周开始明显下降,20周时仅有极少量表达。4周后各时间点两者之间无明显差别。(3)肌皮神经纤维代偿性放大模型组：①NGFmRNA:术后1、3周,神经放大组表达量大于正常对照组；术后1、2、3周,神经切断组表达量大于正常对照组(P<0.05)；术后的2、3周神经放大组表达量大于神经切断组(P<0.05)。4周以后的其余时间点,各组之间无明显统计学差异。各个组NGFmRNA拷贝量均随着手术后时间的移而逐渐下降。②CNTFmRNA:在正常对照组各时间段均高度表达。神经放大组在术后1周即出现明显下降,下降比例在70%以上,之后随着时间的延长,其拷贝量呈现逐渐上升趋势,在术后20周达到顶峰,但依然低于正常对照组水平。神经切断组在术后1周,其值亦明显下降,随着失神经支配时间延长,未出现逐渐下降趋势。4周以后,神经放大组CNTFmRNA的拷贝量多于神经切断组(P<0.05).③BDNFmRNA:在正常对照组,未检测到BDNF的mRNA:在神经放大组,其拷贝量逐渐上升,3周时达到顶峰,之后逐渐下降,8周以后仅少量表达,20周时已经无法检测。神经切断组改变类似于神经放大组,但是处在一个更高的表达水平。④GDNFmRNA:在正常对照组,未检测至GDNFmRNA表达。在神经放大组,其拷贝量从1周上升,之后下降；从8周开始急剧下降。1至12周内,神经切断组的表达量均高于神经放大组,16周后两者之间无明显差别。(4)尺、肌皮神经模型组之间比较：①BDNFmRNA在各时间点远端尺神经的表达量较肌皮神经低(P<0.05);②GDNFmRNA在各时间点,远端尺、肌皮神经的表达量无统计学差异(P>0.05);③NGFmRNA在建模后表达量均增加,3周后平缓下降。建模后的1到3周,其表达量在两神经之间无统计学差异(P>0.05)；4、8和12周时,远端尺神经NGFmRNA表达量低于肌皮神经(P<0.05)；④3周以后的各时间点,远端尺神经的CNTFmRNA表达量均较肌皮神经低(P<0.05)结论尺、肌皮神经纤维代偿性放大模型建立后,缝合口远端的尺神经早期较低的BDNFmRNNA、中晚期较低的NGFmRNA表达量是引起尺神经感觉纤维放大率小于肌皮神经的原因之一。尺神经的CNTFmRNA表达量小于肌皮神经,与尺神经感觉纤维放大率相对较小可能有关,但他们的相互关系及机制有待进一步研究确认。GDNFmRNA的表达水平,未对尺、肌皮神经放大率不同产生明显影响。
【作者】罗鹏波；
【导师】陈亮；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】荧光剂逆行示踪；肌皮神经；尺神经；神经元；神经纤维代偿性放大；运动神经纤维；神经营养因子；BDNF；GDNF；NGF；CNTF；

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