Martentoxin抗惊厥及其锚定BK通道靶标的分子机制研究

【摘要】大电导钙激活钾离子通道（largeconductancecalcium-activatedpotassiumchannels，BK）通道广泛分布于各种细胞和组织中，参与调控众多生理功能，其表达量和功能异常与多种人类疾病密切相关，本论文着重研究了martentoxin（一个自主研发的新型BK通道阻断剂）的在体抗惊厥药效及其与BK通道靶标互作的分子机制。1.Martentoxin对大鼠PTZ模型的抗惊厥效应：本研究发现，martentoxin可抑制由PTZ诱导的大鼠惊厥发作和复发。海马内注射martentoxin能缓解PTZ诱导的大鼠惊厥症状，低剂量的martentoxin（0.05μg）能延长惊厥首次发作的潜伏期，martentoxin（0.05μg和0.5μg）能剂量依赖地减少癫痫样放电的总时程，但对于发作级数没有明显作用。低剂量的martentoxin不但可以延长PTZ复发性模型的惊厥潜伏期，且能显著地抑制PTZ复发模型的惊厥发作时程和级数。2.Martentoxin独钟神经型BK通道的分子基础：神经型BK通道被证明对经典阻断剂charybdotoxin和iberiotoxin不敏感，却可被martentoxin有效地抑制（IC50为72nM）。本章节采用丙氨酸扫描等方法鉴定了位于BK通道孔区的Y294为识别martentoxin的关键性位点，D261和E276对于识别martentoxin并不重要。此外，BK通道的单一α亚基对martentoxin不敏感（即便浓度高达1μM），由此强烈提示，神经型BK通道的β4亚基参与了对martentoxin的识别。于是，将BK通道（α+β4）和（α+β1）的胞外环相互替换构建嵌合体。经电生理检测，BK（α+β1Lβ4）构成的嵌合体对martentoxin敏感，其特征与野生型BK通道（α+β4）吻合；由α+β4Lβ1构成的BK通道的电流可被martentoxin显著增加，其特征与野生型BK通道（α+β1）相似。以上结果清晰地表明，α亚基的孔区和β4亚基的胞外环是神经型BK通道识别martentoxin的关键位点。3.Martentoxin对胶质瘤型BK和BK（α+β1）通道的增强效应：胶质瘤BK（gBK）和BK（α+β1）通道在已知BK通道亚型中对胞内钙离子最为敏感。本研究运用电生理记录、细胞增殖和钙成像等技术检测了martentoxin调制这两种通道的药理动力学参数。当胞内存有Ca2+时，martentoxin能够剂量依赖性地增强胶质瘤BK和BK（α+β1）通道的活性，EC50分别为46.7nM和495nM，但未使该两种通道的稳态激活曲线发生偏移。Martentoxin调制胶质瘤BK和BK（α+β1）通道电流幅值的增大比率与胞内钙浓度的变化无关。iberiotoxin（选择性BK通道孔区阻断剂）能够完全抑制martentoxin对这两种BK通道的增强效应。在胞内缺乏内钙时，martentoxin能够有效地抑制胶质瘤BK通道的活性，而对BK（α+β1）通道没有明显的作用。以上结果提示，martentoxin能以有别于其他已知BK通道阻断剂的作用方式增强胶质瘤型BK和BK（α+β1）通道的活性。4.Martentoxin对β1亚基去糖基化BK通道的药理调制：β1亚基的糖基化是否参与BK通道的功能调节目前似乎鲜有触及。对此，我们运用电生理方法，结合分子突变、生物化学的技术，研究发现，一旦β1亚基经N80A/N142A或β1N80Q/N142Q双突变去糖基化，iberiotoxin对BK通道的抑制效应被显著增强。相比martentoxin则显示出了不同的敏感性。在一定内钙条件下，martentoxin可显著增强糖基化的BK通道活性；而去糖基化的通道则不受影响。有趣的是，在缺乏内钙的情况下，martentoxin有效地抑制去糖基化通道活性；而对糖基化的通道却无此效应。同时，β1亚基N-糖基化也参与了BK通道动力学特征的形成。尽管BK通道激活曲线的V1/2和斜率没有发生改变，但β1亚基去糖基化可显著加快BK通道的激活速率。因此，β1亚基的N-糖基化程度是决定BK通道功能特性的不可轻视要素之一。本论文揭示martentoxin是一种以神经型BK通道为靶点的新型抗癫痫分子、甄别BK通道亚型的独有探针工具，其识别靶通道的机制丰富了钾通道与配体的互作模式，对于深入解析BK通道的生理功能、研发该通道相关疾病的药物均至关重要。
【作者】陶杰；
【导师】吉永华；
【作者基本信息】上海大学，生物信息工程，2014，博士
【关键词】BK；通道；β亚基；膜片钳；Martentoxin；结合位点；

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