实时荧光PCR技术检测奶制品掺假方法研究

【摘要】
【作者】刘小艳；
【导师】傅春玲；
【作者基本信息】苏州大学，营养与食品卫生学，2014，硕士
【目的】运用实时荧光PCR技术建立奶制品中主成分牛、羊及其常见掺假成分谷类、大米、大豆源性成分的定性检测体系，以鉴别检测奶制品相关掺假；并在定性的基础上探索奶粉中牛源性主成分的定量检测方法。
【方法】1.奶制品掺假定性检测体系研究：分别以牛的线粒体细胞色素b基因、羊的线粒体12SrRNA基因为靶基因设计合成牛、羊源性引物探针，以常见掺加物大米、玉米、小麦、高粱、大麦等谷物的叶绿体rbcL基因作为靶基因通过BLAST软件比对选择其同源保守区域设计合成谷类通用性引物探针、以水稻的根部表达基因(gos9)设计合成大米特异性引物探针、以大豆凝集素基因（lectin）为靶基因设计合成大豆特异性引物探针，建立奶类掺假实时荧光PCR检测体系。经对目标成分与奶制品中常添加的非目标成分检测以验证其通用性和特异性，用10倍倍比稀释的目标成分的DNA模板检验其灵敏度，以自制模拟奶类样品检测其在模拟样品检测中的灵敏度及抗干扰能力，并进一步经市售奶类样品检测验证其应用检测能力。2.奶粉中牛源性主成分定量研究：采用实时荧光PCR技术以牛的线粒体细胞色素b基因为靶基因建立不同质量百分比的牛奶粉标准品中的主成分含量与相应Ct值间的定量标准曲线方程，利用标准曲线计算出奶粉中主成分的质量分数。经回收率实验对该方法的准确性进行评估，并将其用于市售婴幼儿奶粉样品的检测以验证其可行性。
【结果】1.奶制品掺假定性检测体系研究：（1）所建立的牛、羊源性主成分定性检测体系在35个循环之内只有目标成分出现阳性扩增，而与其他非目标成分均无交叉扩增，特异性好。灵敏度分别为0.1ng、0.01ng的模板DNA，1%（w/w)、0.5%（w/w)的模拟样品。进一步经市售样品检测验证，只对含目标成分的奶制品扩增阳性，检测结果均与食品标签相符。（2）所建立的谷类通用检测体系在35个循环内，大米、大豆源性检测体系在40个循环内，只针对目标成分进行扩增，与其它非目标成分均无交叉扩增，通用性和特异性好，灵敏度分别为0.01ng、0.1ng、0.1ng的目标DNA，0.5%（w/w)、0.1%(w/w)、0.5%(w/w)的模拟样品，进一步经市售奶类样品检测验证，1份样品被检测出含大豆成分，其它结果均与食品标签相符。2.奶粉中牛源性主成分定量研究：本研究建立的定量标准曲线方程为：y=-0.057x+32.759，相关系数R为0.964，回收率在109%～134%之间，8份市售奶粉样品中检测出3份样品的牛奶含量低于50%，该3份样品进一步经谷类、大米、大豆定性检测体系检测，证实其中有1份样品被非法掺入了非大米谷类源性成分而另2份样品中未检测出非法掺入谷物、大米、大豆植物源性成分。
【结论】本研究建立的奶制品中牛、羊源性成分主成分和谷类通用、大米、大豆源性定性检测体系，经实验验证具有通用、特异、灵敏、实用等优点，可用于奶制品中相关掺假的快速定性检测；本研究建立的奶粉中牛源性定量检测方法能够定量检测出奶粉中的牛源性主成分质量分数，可为有关监督部门的相关食品检测提供技术参考。
【关键词】奶制品掺假；实时荧光PCR方法；定性；定量；

【参考文献】
[1]张华.刑法中因果关系错误问题研究[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[2]刘希慧.若干玉米自交系杂种优势群划分的研究[D].中国农业大学,作物遗传育种,2004,硕士.
[3]王建.《经济生活》参与式教学的探究[D].南京师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[4]蔡竣杰（JeromeTsai）.胸痹心痛证治文献整理研究[D].广州中医药大学,中医内科学,2014,博士.
[5]曾超.HRV分析在心衰诊断和新生儿疼痛检测中的应用研究[D].中南大学,生物医学工程,2014,博士.
[6]孙德林.板式家具的接合与装配技术[J].林产工业.2004(04)
[7]袁晓桥.当代大学生网络道德教育问题研究[D].沈阳师范大学,伦理学,2014,硕士.
[8]沈燕青.基于社会网络分析方法的DTNs组播路由算法[D].华中科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[9]张蕾蕾.福建省城市竞争力评价研究[D].厦门大学,公共管理,2014,硕士.
[10]张建伟,侯朝桢.基于高层体系结构的电力市场分布交互仿真[J].电力系统自动化,2005,17:8-13.
[11]叶英杰.黄芩苷磷脂复合物口服给药胃肠吸收机制以及体内药代动力学研究[D].成都中医药大学,药剂学,2012,硕士.
[12]周丽.基于嵌入式系统的电力电子通用控制开发平台的研制[D].华北电力大学（北京）,电力电子与电力传动,2003,硕士.
[13]刘金文.拟南芥核糖核酸酶YbeY参与叶绿体rRNA加工的功能研究[D].东北林业大学,林木遗传育种,2014,博士.
[14]余伟芳.日本学校生命教育及其借鉴[D].首都师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[15]张燕.国有企业绩效管理中员工行为的研究[D].西北工业大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[16]武甜甜.工伤保险浮动费率机制研究[D].大连理工大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[17]徐宇.基于DSP的弹性浮动研磨主轴与进给控制系统研究[D].广东工业大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[18]刘伟.Web服务在动态电子商务中的应用研究[D].东北财经大学,企业管理,2003,硕士.
[19]陈昊.中小企业信贷业务对城市商业银行盈利的影响研究[D].兰州大学,金融学,2013,硕士.
[20]曾杰,王中仁,周世良,郑海水,白嘉雨.广西区西南桦天然居群遗传多样性的研究[J].植物生态学报,2003,01:66-72.
[21]英大勇.“商业智能”保太平[N].计算机世界,2001-07-09C06.
[22]佟绍成,柴天佑,邵诚.一类大系统的间接自适应分散模糊控制[J].自动化学报,1999,03:71-75.
[23]张鹏.农村集体建设用地流转机制与绩效研究[D].浙江大学,2007.
[24]夏承遗,刘忠信,陈增强,袁著祉.复杂网络上带有直接免疫的SIRS类传染模型研究[J].控制与决策,2008,04:468-472.
[25]秦晓娟.改性石墨烯的制备及其超疏水性能研究[D].兰州理工大学,2013.
[26]刘素洁,严建军,周良晓.石墨烯的现状和展望[J].工业计量,2015,S1:141-143.
[27]周志伟.稀疏阵列阵形优化设计方法研究[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[28]李扬.云计算环境下的QoS冲突解决方案研究[D].内蒙古大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[29]刘敏.氨氮电氧化技术及其在养猪废水中的应用研究[D].上海大学,环境工程,2014,硕士.
[30]侯玉强,方勇杰,杨卫东,鲍颜红,徐泰山,刘福锁,李碧君.综合电压频率动态交互影响的自动减负荷控制新方法[J].电力系统自动化,2010,05:24-28.
[31]欧阳洪.电话交换网优化方案[J].铁道通信信号.2001(01)
[32]文晓燕.列车牵引电机低速运行优化控制研究[D].北京交通大学,2012.
[33]王建淦.纳米二氧化锰基复合材料的制备及其电化学特性研究[D].清华大学,2013.
[34]刘沙沙.移相全桥ZVS变换器寄生振荡抑制方法的研究[D].南京航空航天大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[35]丁山传.忆阻器在有源电力滤波器中的应用[D].太原科技大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[36]陈钧霆.县级政府事权与财力不匹配问题研究[D].中共中央党校,政治学理论,2013,硕士.
[37]刘龙.基于海事监控平台的船舶目标检测与自主跟踪系统的研究[D].湖南师范大学,电路与系统,2014,硕士.
[38]肖化平,陈元平,杨凯科,魏晓林,孙立忠,钟建新.无序双层六角氮化硼量子薄膜的电子性质[J].物理学报,2012,17:532-538.
[39]陈世超.风蚀监测关键传感技术研究及监测系统研制[D].北京林业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[40]林倩如.ALA-PDT对Hela和Caski细胞增殖凋亡机制的初步探讨[D].复旦大学,妇产科学,2012,硕士.
[41]翟晓丽.修正属性识别模型在大气环境质量评价中的应用研究[D].辽宁工程技术大学,环境工程,2011,硕士.
[42]高旭,胥桂仙,孙集伟,牛四清,王宁.一起典型的500kV失灵保护误动分析[J].电力系统自动化,2007,08:104-106.
[43]邵婷婷.《铁木前传》沙博理译本误译分析[J].河北北方学院学报(社会科学版).
[44]张健梅.基于循环经济的企业成本管理研究[D].山东大学,企业管理,2014,博士.
[45]赵琳.仲裁式可扩充多路通信设计及仲裁算法优化研究[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[46]张晓燕,张新海,薛渌.空冷技术热点问题探讨[J].电力设备.2006(03)
[47]夏春光,王琳.PLC在机床改造中的应用[J].一重技术.2000(02)
[48]赵鹏.基于氢氧同位素示踪的紫色土坡耕地产流机制研究[D].西南大学,水土保持与荒漠化防治,2014,硕士.
[49]胡锦城.基于稳定特征的交通标志检测与识别技术研究[D].湖南大学,信息与通信工程,2012,硕士.
[50]李素华.选择性颈段脊神经后跟切断术治疗脑瘫上肢痉挛的临床观察[D].北京中医药大学,中西结合临床医学,2014,硕士.