胱硫醚γ裂解酶/硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞炎症中的作用

【摘要】目的：研究胱硫醚γ裂解酶（Cystathionineγ-lyase，CSE）/硫化氢（Hydrogensulfide,H2S）通路在氧化低密度脂蛋白（OxidizedLDL，ox-LDL）诱导的巨噬细胞炎症中的作用，并探讨其相关机制。方法：以Raw264.7细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞为研究对象，采用ox-LDL建立细胞炎症模型。采用逆转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）及Westernblot法检测胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionineγ-lyase，CSE）的转录及表达变化；采用亚甲蓝法检测细胞外HS-浓度变化；采用瞬时转染技术构建CSE过表达及基因敲减的细胞模型；运用不同的CSE抑制剂为工具药抑制CSE活性；ELISA检测炎症相关因子肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）及细胞间粘附分子（Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)的生成和释放；采用粘附实验检测巨噬细胞与内皮细胞间的粘附；采用Westernblot法检测IκBα及磷酸化IκBα的表达、免疫荧光方法检测NF-κB亚单位p65的亚细胞定位分布，结合ELISA法检测胞核中NF-κB的转录活性；采用Westernblot的方法检测JNK、ERK、P38的磷酸化水平。结果RT-PCR结果显示正常培养条件下Raw264.7细胞仅表达CSE，而不表达胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）。Westernblot和RT-PCR结果显示：与对照组相比，ox-LDL组CSE蛋白水平及mRNA水平均降低（p<0.05），且亚甲蓝法检测细胞外HS-浓度变化结果显示ox-LDL作用后，原代小鼠腹腔巨噬细胞及Raw264.7细胞胞外HS-浓度降低，提示ox-LDL抑制巨噬细胞CSE表达及H2S生成；利用瞬时转染技术构建过表达及敲减CSE，结果发现与转染载体组相比，CSE过表达组ox-LDL诱导的Raw264.7细胞TNF-α产生显著减少（P<0.01），而CSE敲减则使TNF-α产生明显升高（P<0.05）；而用不同的H2S供体NaHS和Na2S预处理，发现与ox-LDL组相比，预处理组TNF-α产生显著降低，原代细胞结果也与此一致；NaHS预处理组ICAM-1生成和释放亦减少；粘附实验结果表明NaHS预处理组巨噬细胞与内皮细胞间的粘附数减少；与H2S供体作用相类似，H2S合成底物cysteine预处理亦可显著降低TNF-α生成，且该作用能被CSE抑制剂PAG和BCA逆转；Westernblot及免疫荧光结果显示，ox-LDL能够促进IκBα、ERK及JNK磷酸化（P<0.01），并明显促使p65向细胞核内转位，而NaHS和Na2S能够抑制IκBα及JNK磷酸化（P<0.05），且减少巨噬细胞核内的p65水平。另外，RT-PCR结果显示NF-κB、ERK、JNK抑制剂均可部分逆转ox-LDL引起的CSE转录下调；ELISA结果显示JNK抑制剂能明显抑制ox-LDL诱导的NF-κB转录活性增加。结论：CSE/H2S通路在ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症模型中发挥重要的抗炎作用，ox-LDL可通过抑制JNK/NF-κB通路而减少CSE/H2S表达，从而加剧炎症发生。本研究可能为动脉粥样硬化治疗提供一个新的靶点。
【作者】王贤慧；
【导师】刘春风；胡丽芳；
【作者基本信息】苏州大学，神经病学，2014，硕士
【关键词】ox-LDL；CSE；硫化氢；JNK；炎症；Raw264.7；

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