MBP原核表达及其对树突状细胞表型和功能成熟的影响

【摘要】背景和目的麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)是近年发现的免疫佐剂,它可提高重组亚单位疫苗的免疫原性。研究发现,MBP具有广泛的免疫活性,可激活NK细胞、巨噬细胞和Th1细胞；也可通过TLR4活化DC,产生前炎症因子参与免疫。由此提示MBP可作为免疫增强剂,单独作用时也可提高机体免疫应答。DC是功能最强的专职性抗原提呈细胞(antigen-presentingcell,APC),是唯一能直接激活初始T细胞的专职性APC,在固有免疫和适应性免疫中均发挥着重要的作用。DC的发育分为成熟与未成熟阶段,两者具有不同的生物学特征和细胞表型。非成熟DC低表达MHC分子和CD40、CD54、CD80、CD86等共刺激分子和粘附分子；成熟的DC高表达CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40等共刺激分子,和细胞间粘附分子ICAM-1(CD54)等。迄今,有关MBP的研究,主要集中在研究MBP融合重组蛋白的活性。然而关于MBP直接作用于免疫系统,并提高疫苗免疫应答反应的机制还不清楚。所以,本课题通过构建MBP原核表达载体,表达并分离纯化MBP,在此基础上,研究MBP对DC分化和功能成熟的影响。旨在为阐明MBP作为新型免疫增强剂的分子机制提供新的实验依据,为疫苗佐剂的研究提供新的线索。方法1.构建MBP原核表达系统：以大肠杆菌K12DNA为模板,PCR扩增malE基因并构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的蛋白MBP表达情况,AmyloseResin柱提纯MBP.WesternBlot鉴定MBP的免疫反应性。2.DC2.4细胞系的培养：DC2.4培养于含10%FCS的RPMI-1640完全培养基(含300mg/L谷氨酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素)。3.实验分组：实验分为3组,1)空白对照组；2)1μg/mlMBP组；3)5μg/mlMBP组。收集DC2.4细胞,各组分别用以下方式处理：1)空白对照组,即DC2.4组；2)DC2.4+1μg/mlMBP;3)DC2.4+5μg/mlMBP.然后将24孔板放入37℃、含5%CO2的孵箱中培养10h。收集细胞和培养上清,分别用于DC表型和细胞因子浓度检测。实验重复3次。4.DC2.4表型变化的检测：流式细胞术分析DC表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ表达。5.细胞因子检测：ELISA检测培养上清中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12及IL-23的浓度。结果1.所克隆的malE基因DNA序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能成功表达MBP蛋白。WesternBlot鉴定后确为MBP蛋白。2.MBP可刺激DCs表面分子CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ分子表达,MHC-Ⅱ分子的表达略有下降。未处理组DC2.4表面CD40、CD54、CD80、CD86、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ的相对平均荧光强度(ΔMFI)分别为23.45±1.68、335.15±6.55、3.54±0.36、60.75±4.18、250.15±5.43和64.35±6.02；DC2.4与1MBP共培养之后,ΔMFI分别为35.65±1.30、412.15±10.27、5.45±0.20、145.15±6.55、343.15±13.21和43.05±4.15；DC2.4与5μg/mLMBP共培养之后,ΔMFI分别为31.45±1.95、410.15±4.52、5.51±0.20、150.15±7.01、391.15±6.66和25.05±4.42。与未处理组相比,MBP处理组DC2.4表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86和MHC-1分子表达增加,MHCⅡ分子的表达下降。3.MBP增强DCs分泌IL-23,但对IL-1β、IL-6和IL-12的表达无显著影响。未处理组DC2.4培养上清液中细胞因子IL-1βIL-6、IL-12和IL-23的含量分别为(pg/mL):1025.50±35.36、311.9±27.02、18.4±1.15和2.3±2.08；1μg/mLMBP处理后,培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分别为(pg/mL):937.00±53.03、332.8±1.09、16.5±0.86和26.4±2.08；5μg/mLMBP处理后,培养上清液中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23的含量分别为(pg/mL):945.50±21.21、311.13±21.58、16.5±2.29和26.44±2.12,而数据表明：与未处理组DC2.4相比,MBP处理组DC2.4分泌IL-23增加,IL-1β、IL-6、IL-12无显著变化。结论MBP可能可促进DC对内源性抗原的提呈,抑制DC对外源性抗原的提呈；促进DCs分泌细胞因子IL-23,可能促进Th17亚群的分化、扩增和存活。
【作者】翁秀妹；
【导师】潘建平；
【作者基本信息】浙江大学，免疫学，2014，硕士
【关键词】树突状细胞；麦芽糖结合蛋白；大肠杆菌；抗原提呈；

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