葡萄糖转运蛋白-1在CD133+喉癌Hep-2细胞中的表达

【摘要】葡萄糖转运蛋白-1在CD133+喉癌Hep-2细胞中的表达体外研究背景和目的：喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤,但2012年美国癌症协会发现喉癌患者的5年生存率反而有所下降。因此,提高喉癌患者生存率、保留喉功能以提高生活质量是该领域临床工作者长期努力的目标。放射治疗是局部复发以及难以手术切除的晚期喉癌的主要治疗手段,而这些喉癌患者易产生放射抵抗或耐受,导致治疗失败,因此需要新的治疗策略以提高喉癌的放射敏感性。放射抵抗的机理尚不清楚,近来发现肿瘤干细胞(CSC)在肿瘤放射抵抗中起重要作用,若要彻底治愈肿瘤,必须清除这类细胞。因此,要提高放疗疗效,需解决CSC放射抵抗问题。喉癌肿瘤干细胞(CSC)已被证实明确存在,在人类喉部肿瘤中CD133是一个非常有用的假定的肿瘤干细胞标记物。许多研究证实,CD133+CSC比CD133-的CSC具有更高的克隆源性、侵袭性和致瘤能力。CD133+细胞具有化疗抵抗及放疗抵抗。然而大部分CD133+的CSC是否具有特殊的代谢机制目前尚未明确。近来,人们对CSCs细胞龛的Warburg效应越来越感兴趣。18FDGPET(18F-氟代脱氧葡萄糖PET)在临床肿瘤学中的广泛应用将有助于原发灶不明的颈部转移性肿瘤和其它许多肿瘤的诊断、分期、复发及治疗检测。Warburg效应是在有氧条件下肿瘤细胞主要依赖于糖酵解方式进行代谢,而非氧化磷酸化的方式,这种异常代谢方式被认为是肿瘤细胞的特征之一。在许多肿瘤中,葡萄糖主要用于糖酵解途径。人们已经发现,干细胞表达高水平的糖酵解酶并且主要依赖糖酵解来满足它们的能量需求,而葡萄糖又是通过葡萄糖转运蛋白实现跨膜转运的。目前有许多研究,包括我们的研究在内,结果显示GLUT-1在恶性葡萄糖代谢中起重要作用,它可能会导致氟代脱氧葡萄糖(FDG)摄取增加,因此,我们认为肿瘤干细胞微环境中GLUT-1表达增高可能参与肿瘤干细胞放射抵抗,通过抑制GLUT-1的表达可提高恶性肿瘤的放射敏感性。然而关于CSC中GLUT-1表达的相关研究却很少。只有在甲状腺癌、小儿血管瘤和中枢神经系统胚胎性肿瘤中证实CD133+细胞的GLUT-1的表达高于CD133-细胞。因此,CSCs中Warburg效应及GLUT-1的表达需要更深入的研究。本研究以CD133+喉癌Hep-2细胞为切入点,检测喉癌细胞CD133+细胞GLUT-1的表达情况,明确喉癌CD133+细胞中GLUT-1表达与喉癌细胞生长有关,为下一步研究喉癌肿瘤干细胞在喉癌放射抵抗中的机理提供一定的理论依据。材料与方法：在本实验中,我们对Hep-2喉癌细胞进行培养,观察细胞的增殖情况；并通过实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测喉癌Hep-2细胞中CD133、GLUT-1的表达；使用流式细胞仪分选CD133阳性(+)喉癌Hep-2细胞;CCK-8检测分选CD133+喉癌Hep-2细胞及CD133-喉癌Hep-2细胞活性；RT-PCR检测分选CD133+喉癌Hep-2细胞及CD133-喉癌Hep-2细胞GLUT-lmRNA的表达；Westernblotting检测分选CD133+喉癌Hep-2细胞及CD133-喉癌Hep-2细胞GLUT-1蛋白表达。结果：1、PT-PCR技术显示CD133产物有213个碱基对。2、CD133的解离曲线分析显示预期高峰在82.1℃,CD133的平均ACt值为10.98。3、用FACS分选(流式细胞术分选)得出：在分选之前CD133+细胞所占的分数为1.2%,在分离之后上升至76.1%。4、连续实验还证明了分选后细胞生长良好,CD133+细胞与CD133-细胞在前3天的增殖情况无差异(P<0.05),从第4天开始,CD133+细胞在体外的增殖能力高于CD133-细胞(P<0.05)。在CD133+细胞与CD133-细胞中GLUT-1mRNA的表达平均ACt分别为：6.40,5.14(P<0.05)；GLUT-1蛋白的平均体积(相对于β-Tublin蛋白而言)分别为0.48±0.02,021±0.03(P<0.05)。由此可以认a、CD133+细胞比CD133-细胞增殖更快；b.GLUT-1mRNA与GLUT-1蛋白在CD133+细胞中的表达高于在CD133-细胞中的表达。结论：1.GLUT-1在CD133+Hep-2喉癌细胞的能量供给中起一定作用；2.GLUT-1可能成为抑制喉癌干细胞增殖的一个潜在的治疗靶点。
【作者】陈晓红；
【导师】周水洪；
【作者基本信息】浙江大学，耳鼻咽喉科学，2014，硕士
【关键词】喉癌；肿瘤干细胞；CD133；葡萄糖转运蛋白-1；Warburg效应；

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