针刺及针药结合对急性手术创伤大鼠的镇痛效应及中枢Orexin系统参与针刺镇痛的研究

【摘要】急性手术创伤所致的术后疼痛是外科手术后出现的手术伤口局部疼痛,属急性疼痛范畴。有资料显示,外科手术后疼痛发生率高达19%-56%,其发生与手术麻醉方式的选择等因素密切相关,疼痛程度以中度为主。术后疼痛严重影响患者的生存质量,因此选择安全、有效、生理干扰小的麻醉方式是解决外科术后疼痛的主要途径之一。针刺镇痛是我国传统医学的特色,以其确切的临床疗效在临床应用中一直有着活跃的生命力。多项临床资料显示,针刺可广泛应用于颅脑手术、甲状腺切除术、肺切除术、胃切除术、胆囊切除术等多种外科手术,针刺不但能够缓解患者的术后疼痛,而且能够调节免疫功能,促进创伤的恢复。深入研究针刺在手术创伤后疼痛中的作用对于阐释针刺镇痛的机理具有重要的意义。回顾针刺镇痛机理研究历程可以发现,早期针刺镇痛实验研究主要以急性伤害性疼痛刺激为致痛因素,与临床疾病有一些差异。目前对于模拟临床外科手术急性创伤的针刺研究很少,主要是因为缺少与临床外科手术相对应的急性痛动物模型,因此为了深入开展针刺对于急性手术创伤疼痛的实验研究,急需建立急性手术创伤疼痛的小动物实验模型。其基本要求一是模拟临床手术操作造成的急性手术创伤和疼痛,二是能及时进行针刺干预并进行疼痛的测试。这对于研究针刺镇痛和针刺麻醉的机制,显然是十分重要的。针刺镇痛机制的主要研究成果有针刺镇痛的神经通路机制和针刺镇痛的神经化学机制两个方面。阿片肽与针刺镇痛的关系因首先被证实而成为经典,而后非阿片肽系统在针刺镇痛机制中的作用也吸引了更多的研究兴趣。以往研究已发现,针刺镇痛效应与中枢内多种神经肽有关,包括P物质(SP),血管活性肠肽(VIP),神经肽Y(NPY)等。Orexin是一种完全由下丘脑生成的神经肽,分OrexinA和B两种(OXA,OXB),分别是33肽和28肽,它们均由一种前体Prepro-Orexin生成。Orexin的受体是G蛋白偶联受体,有OX1R和OX2R两种亚型。Orexin在中枢神经系统内有广泛的纤维投射,同时参与多种生理过程,包括睡眠觉醒、进食行为、心脏自律性以及神经内分泌。近年来越来越多的研究支持Orexins尤其是OXA在痛觉调制过程中可能发挥着重要的作用。首先是在痛觉调制的各水平,包括中脑导水管周围灰质(PAG)、延髓头端腹内侧网状结构(RVM)、脊髓背角(DH)和背根神经节(DRG)均存在下丘脑OXA能纤维直接投射；其次,行为学依据也表明,中枢给予外源性OXA对机械痛、热痛有抑制作用,且其抗伤害作用不被纳络酮阻断。以上证据提示OXA不但参与脊髓与脊髓上抗伤害反应过程,亦可能是通过参与疼痛的下行抑制系统进而调节疼痛感受,且OXA可能是存在于阿片肽系统外的镇痛物质。那么针刺镇痛过程是否也调动了OXA的激活,OXA对于针刺镇痛是协同作用还是拮抗作用,其进一步机制又如何?为了验证这一假说,我们采用改良的开腹手术建立的急性术后疼痛大鼠模型,从行为学到形态学等不同方面,从整体到分子等不同水平,运用机械痛和热痛测定方法,结合免疫组织化学、逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦等方法,对针刺及针药结合对急性手术创伤后疼痛的协同镇痛作用和中枢Orexin系统参与针刺镇痛的机理研究进行探讨。实验结果如下：1.急性手术创伤模型的建立及评价1.1麻醉药乙醚对大鼠机械痛阈及热痛阈的影响为了排除麻醉药乙醚对大鼠痛阈的影响,大鼠随机分为正常组和麻醉组,每组各8只,麻醉组大鼠进行乙醚全身麻醉并维持15min。结果显示,与正常组相比,乙醚麻醉组大鼠的足机械痛阈(PWT)、腹机械痛阈(ACT)、足热痛阈(PWL)、热水甩尾潜伏期(TFL)均无显著改变(P>0.05)。因足机械痛与腹机械痛均显示出较稳定的阈值,故后续试验采用该两项指标进行痛阈测定。1.2急性手术创伤对大鼠腹机械痛和足机械痛阈的影响大鼠随机分为正常组,假手术组和模型组,每组各8只。在乙醚吸入麻醉下进行大鼠腹部正中切口手术。假手术组是麻醉维持15分钟,腹部剃毛、消毒。结果显示,模型组大鼠术后0.5h时腹部即出现痛觉超敏并持续至24h以上,与假手术组相比均具有显著性差异(P<0.01)。而假手术组与正常组相比没有明显的痛阈改变。足部机械性阈值测定结果显示,假手术组与正常组相比没有明显的痛阈改变。与假手术组相比,模型组大鼠术后0.5h时足部开始出现痛觉超敏并持续至24h,与正常组相比均有显著性差异(P<0.01)。上述实验初步揭示了急性手术创伤疼痛造模及痛阈测定方法是切实可行的。1.3芬太尼对模型大鼠的镇痛作用为进一步验证大鼠急性手术创伤模型用于痛与镇痛实验的可靠性,采用麻醉镇痛药芬太尼外周给药,观察模型大鼠痛阈的变化。大鼠随机分为生理盐水组(Saline组)、芬太尼小剂量组、中剂量组和大剂量组,分别于术后即刻给予Saline0.2ml、芬太尼5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg肌肉注射。结果显示,芬太尼10μg/kg与20μg/kg能够剂量依赖性缓解大鼠腹部切口痛敏和足部痛敏,作用维持时间至术后2h,与Saline组相比具有显著性差异(腹部P<0.01,足部P<0.05)。小剂量芬太尼(5μg/kg)并不能缓解模型大鼠的腹部切口痛敏及足部痛敏。本测痛实验中PWT与ACT这两个测痛指标对最大镇痛效果的反应无统计学差异。小结：腹部正中切口手术所致急性创伤模型能够引起大鼠腹部和足部机械性痛敏,且痛敏持续达24h以上。10μ/kg和20μg/kg芬太尼能够剂量依赖性缓解该急性手术创伤所致的疼痛。实验显示,该急性手术创伤大鼠的测痛模型是稳定可靠的。2.电针对手术创伤模型大鼠急性痛的镇痛作用2.12/15Hz和2/100Hz电针对模型大鼠腹机械痛和足机械痛的影响大鼠随机分为模型组、假电针组、电针2/15Hz组和电针2/100Hz组,每组8-11只。电针结束后0.5h,1h,2h,4h,6h及24h时测定腹机械痛和足机械痛。腹部测痛结果显示,与模型组相比,术后0.5h及1h时,两种频率电针对于腹部痛敏均有显著缓解作用,差异有统计学意义(p<0.05)；0.5h时,电针2/15Hz组与假电针组相比也有显著性差异(P<0.05)。但电针2/100Hz组与假电针组相比具有差异趋势,但尚未达到显著性差异。足部测痛结果显示,术后0.5h时,两种频率电针均能缓解足部机械痛敏,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),其中0.5h时电针2/15Hz组与假电针组相比也有显著性差异(P<0.05)。但电针2/100Hz组与假电针组相比具有差异趋势而尚未达到显著性差异。2.2电针与芬太尼合用对模型大鼠腹机械痛和足机械痛的影响基于以上实验结果,2/15Hz电针即刻镇痛效应较2/100Hz明显,因此选择2/15Hz作为后续实验的电针参数。为观察电针合用小剂量芬太尼的协同镇痛作用,大鼠随机分为Saline组(术后即刻注射Saline0.2ml作为对照)、小剂量芬太尼组(5μg/kg)、电针合用Saline组、电针合用小剂量芬太尼组,每组7-8只。结果显示,小剂量芬太尼(5μg/kg)注射后,腹部痛阈及足部痛阈与Saline组相比没有明显改变(P>0.05)。与Saline组相比,电针合用Saline组0.5h时的腹部痛阈及足部痛阈显著提高,差别均有统计学意义(P<0.05)。腹部痛阈测定结果还显示,与小剂量芬太尼组相比,电针合用小剂量芬太尼组腹部痛阈在0.5h、1h及24h时均明显升高,两者比较有统计学差异(P<0.05)；与电针合用Saline组相比,电针合用小剂量芬太尼组腹部痛阈均值在术后24h有升高趋势。足部痛阈测定结果还显示,与小剂量芬太尼组相比,电针合用小剂量芬太尼组足部痛阈在0.5h、1h和4h至24h内均明显升高,两者比较有统计学差异(P<0.05)；与电针合用生理盐水组相比,电针合用小剂量芬太尼组足部痛阈均值在0.5h、6h及24h时均明显升高,两者比较有统计学差异(P<0.05)。小结：2/15Hz和2/100Hz两种频率电针对急性术后痛大鼠均有即刻镇痛效应。与单独使用电针或小剂量芬太尼相比,2/15Hz电针与小剂量芬太尼合用后对腹部和足部机械性痛阈的均值均有提高,不但即刻镇痛效果得到显著增强,而且出现后续的镇痛效应,时程明显延长。3.鞘内注射OXA、纳洛酮及选择性OXlR受体拮抗剂SB-334867对急性手术创伤模型大鼠腹机械痛及电针镇痛的影响3.1鞘内注射OXA对模型大鼠腹机械痛阈的影响大鼠随机分为Saline组、OXA小剂量组、OXA中剂量组、OXA大剂量组,每组6-8只,手术结束后立即鞘内注射Saline10μl、OXA0.1nmol、0.3nmol和1nmol。随即进行痛阈测定。结果显示,与Saline对照组相比,OXA0.1nmol对模型大鼠痛阈没有明显作用。注射后0.5h,OXA0.3nmol和1nmol均能够升高大鼠腹部机械性阈值,与Saline组比较有统计学差异(P<0.05)。OXA0.3nmol和1nmol两组之间无统计学差异。3.2鞘内注射选择性OX1R拮抗剂SB-334867及纳络酮对OXA镇痛作用的影响大鼠随机分为Saline组、OXA0.3nmol组、SB-33486730nmol组、SB-33486730nmol+OXA0.3nmol组和纳络酮28nmol+OXA0.3nmol组,每组7-8只。SB-33486730nmol及纳络酮28nmol为手术前鞘内注射,OXA与Saline为术后即刻鞘内注射。结果显示,术后0.5h时,与Saline组相比,OXA0.3nmol组的ACT明显升高(P<0.05),而SB-33486730nmol组大鼠的痛阈没有显著改变(P>0.05)；SB33486730nmol+OXA0.3nmol组与OXA0.3nmol组相比,腹机械痛阈升高不明显,具有统计学差异(P<0.05)。纳络酮28nmol+OXA0.3nmol组腹机械痛阈与OXA0.3nmol组相比没有统计学差异(P>0.05)。表明OXA的镇痛作用可被OXlR拮抗剂所阻断,但不被阿片受体拮抗剂纳洛酮所阻断。3.3鞘内注射OXA对电针镇痛的影响大鼠随机分为Saline组、电针组、OXA0.3nmol组和电针+OXA0.3nmol组,每组8-11只。电针结束后即刻注射OXA0.3nmol。结果显示,鞘内注射OXA0.3nmol后1h,与OXA0.3nmol组相比,电针+OXA0.3nmol组大鼠腹部机械性阈值显著增加,具有统计学差异(P<0.05)。与电针组相比,电针+OXA0.3nmol组的腹部机械痛阈有升高趋势。3.4鞘内注射选择性OX1R拮抗剂SB-334867对电针镇痛的影响大鼠随机分为DMSO组、电针组、SB-33486730nmol组、SB-334867100nmol组、SB-33486730nmol+电针组和SB-334867100nmol+电针组,每组7-11只。结果显示,与DMSO组相比,SB-33486730nmol和SB-334867100nmol对模型大鼠的痛阈无明显影响(P>0.05)；与电针组相比,SB-334867100nmol+电针组痛阈明显降低,两者相比有统计学差异(P<0.05)。但SB-33486730nmol+电针组与电针组相比,痛阈没有显著差异(P>0.05)。3.5鞘内注射选择性OX1R拮抗剂SB-334867100nmol对芬太尼镇痛的影响大鼠随机分为Saline组、芬太尼10μg/kg组、SB-334867100nmol组和SB-334867100nmol+芬太尼10μg/kg组,每组7-8只。SB-334867为术前即刻鞘内注射,芬太尼为术后即刻肌肉注射。结果显示,与Saline组相比SB-334867100nmol组痛阈没有显著改变；0.5h和1h时,芬太尼10μg/kg组和SB-334867100nmol+芬太尼10μg/kg组与Saline组比较分别具有统计学差异(P<0.05),芬太尼10μg/kg组和SB-334867100nmol+芬太尼10μg/kg组之间比较没有统计学差异,即预先鞘内注射SB-334867100nmol对芬太尼引起的腹部机械性阈值升高没有显著影响(P>0.05)。小结：(1)鞘内注射OXA对急性手术创伤模型大鼠具有镇痛作用,OXA合用电针后镇痛效果增强；(2)鞘内注射选择性OX1R拮抗剂能够拮抗OXA产生的镇痛作用,SB-334867大剂量(100nmol)能拮抗电针的镇痛作用。(3)μ阿片受体拮抗剂纳络酮不能拮抗OXA产生的镇痛作用,SB-334867100nmol也未能拮抗μ阿片受体激动剂芬太尼的镇痛效果。综上,中枢OXA可能通过OX1R介导参与电针对急性手术创伤的镇痛作用。4.电针对大鼠中枢OXA及OXlR表达的影响4.1电针对模型大鼠下丘脑、PAG和脊髓OXA蛋白含量的影响运用ELISA方法检测正常组、模型组、电针2/15Hz组和电针2/100Hz组下丘脑、PAG和脊髓中OXA的蛋白含量。结果显示,与正常组相比,手术后1h时模型组大鼠下丘脑、PAG和脊髓的OXA含量显著减少,两者比较有统计学差异(P<0.05)；与模型组相比,电针2/15Hz可以显著上调下丘脑、PAG和脊髓的OXA的含量,两者比较有统计学意义(P<0.05)。电针2/100Hz组下丘脑、PAG和脊髓OXA的表达和模型组相比没有显著差异。4.2电针对模型大鼠下丘脑OXAmRNA表达的影响运用RT-PCR方法检测术后2h、4h两个时间点正常组、模型组和电针2/15Hz组下丘脑OXA的mRNA表达。结果显示,与正常组相比,术后2h下丘脑OXAmRNA表达下降(P<0.05)；与模型组相比,电针可以显著增加下调的OXAmRNA(P<0.05)。而术后4h各组之间OXAmRNA表达没有显著差异。4.3电针对模型大鼠下丘脑Orexin能神经元表达的影响运用免疫组化方法检测正常组、模型组、电针2/15Hz组和电针2/100Hz组大鼠下丘脑Orexin能神经元的表达。结果显示,术后2h时,与正常组相比,模型组和电针组下丘脑Orexin能神经元表达均没有显著改变。4.4正常大鼠下丘脑、PAG、延髓和脊髓OX1R的表达OXA的功能要通过与受体结合而发挥。运用免疫组化法标记正常大鼠下丘脑、中脑、延髓和脊髓的OX1R表达。结果显示,在下丘脑腹侧、PAG、延髓腹内侧网状结构和脊髓背角,OXlR呈阳性表达与分布。4.5电针对模型大鼠下丘脑、PAG、脊髓OXIRmRNA表达的影响运用RT-PCR方法检测正常组、模型组、电针2/15Hz组和电针2/100Hz组大鼠术后2h下丘脑OX1RmRNA的表达。结果显示,与正常组相比,模型组下丘脑OX1RmRNA表达上调；与模型组相比,电针2/15Hz组能够进一步上调下丘脑OX1R的表达(P<0.05),而电针2/100Hz组没有明显变化。同样方法检测术后2hPAG中OX1RmRNA的表达,结果显示,与正常组相比,模型组PAGOX1RmRNA表达下调；与模型组相比,电针组能够显著上调PAG中OX1R的表达(P<0.05),而电针2/100Hz组没有明显变化。同样方法检测术后2h脊髓OX1RmRNA的表达,结果显示,与正常组相比,模型组脊髓OX1RmRNA表达下调；与模型组相比,电针组能够上调脊髓OX1R的表达(P<0.05),而电针2/100Hz组没有明显变化。4.6模型大鼠术后下丘脑Orexin能神经元纤维投射运用免疫双标的方法,观察OXA-LI阳性细胞与NeuN的双标,结果显示,OXA主要存在于NeuN阳性神经元的胞浆中；且手术后Orexin能纤维投射可见明显变粗。小结：手术后2h,模型大鼠下丘脑、PAG与脊髓的OXA含量减少,下丘脑OXAmRNA表达下调,而电针能够上调OXA的含量及OXAmRNA的表达;模型大鼠下丘脑OX1RmRNA表达上调,而PAG和脊髓OX1RmRNA表达下调,而电针能够在原有基础上进一步上调OX1RmRNA的表达。提示电针有可能通过调控中枢Orexin系统而实现镇痛作用。结论：围手术期针刺对大鼠急性手术创伤后疼痛有即刻镇痛效应,电针与小剂量芬太尼合用能够增强电针镇痛的效应,并能延长电针镇痛时程；鞘内注射OXA可以缓解急性手术创伤后疼痛,纳洛酮未能拮抗OXA的镇痛效果,鞘内注射选择性OX1R拮抗剂SB-334867能够分别拮抗OXA以及电针的镇痛效果,但不能拮抗芬太尼镇痛效果；电针能够上调急性创伤大鼠下丘脑、PAG和脊髓内源性OXA和OX1RmRNA的表达,以上提示OXA可能通过下行抑制系统的OX1R参与电针镇痛,且OXA的镇痛机制可能不同于阿片肽系统。
【作者】丰晓溟；
【导师】吴根诚；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合基础，2010，博士
【关键词】针刺镇痛；OrexinA；急性手术创伤痛；OX1R；针药复合麻醉；

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