绳状青霉耐酸分子机制研究

【摘要】自然界中,各种极端环境下均有生物体存在,如高温、强酸碱性条件、盐度、高压及辐射条件。生存在极端环境下的生物称为极端微生物。各种微生物适应极端环境的机制为研究大多数物种在其生物进程中的基本特征提供了独特的视角。嗜酸微生物是指能够在pH1.0下生长,且在pH小于4.0时活跃生长的微生物,其耐酸的相关机制尚不清楚。本论文进行了绳状青霉X33耐酸分子机制的探索。分离得到一株耐酸的绳状青霉X33,该菌具有广泛的生长pH范围,为pH0.6-13.0。利用农杆菌介导转化方法建立了绳状青霉X33转化系统并进行了优化,构建了T-DNA插入突变体库。针对转化过程中4个关键因素,即绳状青霉X33孢子的新鲜程度、预培养培养基和共培养培养基中AS的有无以及浓度、共培养时间、绳状青霉X33孢子悬液和农杆菌菌液的比例,对农杆菌介导绳状青霉X33转化效率的影响建立了高效的生长青霉转化体系。利用该转化系统构建了含有9300株转化子的突变体库,Southern杂交显示转化子基因组中,T-DNA插入拷贝数为1-2个,其中87.7%为随机单拷贝插入。对绳状青霉X33T-DNA插入突变体库进行表型筛选,发现了几株形态异常的突变子。以不耐酸突变体M4为研究对象,利用TAIL-PCR技术,克隆得到一个基因,命名为PfMFS（基因号：KF815490）。经比对,该基因与马尔尼菲青霉（.PenicilliummarneffeiATCC18224）保守的假想蛋白（XP002144911）具有88%的同源性。它包含一个1656bp的开放阅读框ORF,编码551个氨基酸。BLASTP分析显示,该基因编码的氨基酸是主要协助转运蛋白超家族（MFS）成员。这些结果显示,该假想蛋白是一种新的MFS转运体,但是其功能尚不清楚。序列分析可知,农杆菌转化过程中T-DNA插入在PfMFS基因的启动子区-372。为了进一步确定PfMFS基因在绳状青霉X33耐酸性状中的作用,为此我们采用以同源重组为基础的基因敲除技术,利用农杆菌侵染的转化方法将野生菌的PfMFS基因敲掉,并通过Southern杂交和PCR进行了验证。结果显示PfMFS基因缺失突变株在pH1.0生长极为缓慢,进一步说明PfMFS基因在绳状青霉X33耐酸性状中发挥作用。通过回补实验,以质粒p3SR2为骨架构建了回补载体p3SR2-PfMFS,采用电击转化萌发孢子方法,将PfMFS基因重新导入敲除突变体M7,并用RT-PCR、Northern杂交等实验进行验证。该数据说明突变体M4和M7性状的改变是PfMFS基因的作用。为了测定绳状青霉X33原生质体体内pH,制备了原生质体,用高效荧光探针BCECF-AM进行测定。敲除突变体M7由于PfMFS基因被破坏,其原生质体内pH较野生菌低。这一结果显示了PfMFS基因在维持绳状青霉X33细胞内pH稳态的重要性。为了进一步研究PfMFS基因的生物学功能,进行了异源表达实验。酵母转化子PfMFS-22在pH2.0的YPD培养基上的生长情况好于含空载的酵母,在pH1.0下都不生长,pH3.0生长几乎相同。结果说明,绳状青霉X33PfMFS基因在低pH下对酸性环境具有抵抗能力。绳状青霉X33敲除突变体M7对NaCl不敏感,野生菌在NaCl存在的情况下生长量增加。在原生质体悬浮液pH的测定实验,原生质体悬浮液中加入25mM的NaCl,测其pH,结果显示加入NaCl之后,野生菌的pH显著降低,而敲除突变体几乎不变。结果说明,Na+与PfMFS转运体相关联,PfMFS转运体可能是一个Na+依赖性MFS运转体。PfMFS基因的细胞定位,构建了融合表达载体pROKlI-GFP-PfMFS,转化农杆菌EHA105,侵染洋葱表皮细胞并在其中进行表达,在荧光显微镜下进行观察,绿色荧光出现在细胞膜的位置,所以PfMFS转运体是一个膜蛋白。
【作者】徐晓雪；
【导师】李多川；
【作者基本信息】山东农业大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】极端微生物；嗜酸菌；绳状青霉；耐酸机制；基因敲除；

【参考文献】
[1]沈国峰.基于双目立体视觉的牙颌模型测量技术研究[D].南京航空航天大学,航空宇航制造工程,2013,硕士.
[2]刘会峰.去神经对大鼠前列腺组织中b-FGF表达的影响[D].遵义医学院,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[3]郭记伟.预掘复合顶板大垂高巷道围岩控制技术[D].中国矿业大学,采矿工程,2014,硕士.
[4]薛壬海.中国钢铁企业应对危机的思考[J].冶金自动化,2013,05:1-4.
[5]崔瑞.无线中继网络中的协作式视频流传输跨层优化研究[D].华中科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[6]蒙裕欢.物种全基因进化分析揭示季节性物种受到更强的正选择[D].华南理工大学,生物工程,2012,硕士.
[7]王海燕.科尔沁沙地坨甸交错区土壤物化特性的空间变异规律研究[D].内蒙古农业大学,水文学及水资源,2013,硕士.
[8]汪庆森.模型移植及其在浸出过程建模中的应用研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2011,硕士.
[9]王卡停,吴铁军.锅炉管精整线Petri网物流仿真器的设计与实现[J].冶金自动化,2003,03:52-54.
[10]崔志平.共振瑞利散射和荧光法在测定多糖、维生素和利尿药中的新应用研究[D].西南大学,无机化学,2013,硕士.
[11]李辉.社会主义管理的历史、逻辑与趋势探析[D].南京师范大学,科学社会主义,2014,博士.
[12]刘翠云.大学英语专业学生英语学习动机与教师话语反馈关系研究[D].鲁东大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[13]王婧.Ba（Ti，Zr，Sn）O_3基自然极性陶瓷的制备及物性研究[D].山东大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[14]李艺明,张应利.数据挖掘在移动通信业客户流失管理中的应用[J].广东通信技术,2005,03:31-35.
[15]李茂军,童调生.单亲遗传算法及其全局收敛性分析[J].自动化学报,1999,01:71-75.
[16]缪克强.左室舒张功能不全血清脑钠肽的改变及卡维地洛对其的影响[D].浙江大学,内科学,2004,硕士.
[17]何平滚.鲁迅小说与审美教育[D].华中师范大学,学科教学论,2003,硕士.
[18]陈刚.经济增加值（EVA～（？））在财务管理中的应用研究[D].中国农业大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[19]朱德新.PtrICE1的抗寒功能鉴定及作用机制[D].华中农业大学,植物学,2014,硕士.
[20]李新泽.低功耗专用指令集处理器设计与优化[D].湖南大学,微电子与固体电子学,2011,硕士.
[21]孙胜杰.20世纪中国文学中的鲧禹原型阐释[J].聊城大学学报(社会科学版),2014,03:50-56.
[22]智锁红.基于聚偏氟乙烯的有机—无机复合膜的研究[D].浙江大学,高分子化学与物理,2014,博士.
[23]唐春玲.激发中职学生英语学习动机研究[D].广东技术师范学院,职业技术教育学,2014,硕士.
[24]宋文香.民办高校烟台南山学院品牌战略研究[D].山东师范大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[25]裴凯乾.钛合金环件控温轧制的研究[D].燕山大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[26]魏秀琴.河南汉族人群IL-1F5基因microRNA靶序列单核苷酸多态性与胃癌易感性的关系[D].郑州大学,流行病与卫生统计学,2013,硕士.
[27]姜小飞.SZ公司LED车灯项目融资方案设计[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[28]刘磊.工业园区农地转用中地方政府策略演化博弈研究[D].中国地质大学（北京）,土地资源管理,2014,硕士.
[29]檀盼龙.基于DSP的永磁同步电机驱动器的研究[D].天津理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[30]王建国.李昌奎案件研究[D].黑龙江大学,法律,2012,硕士.
[31]赵伟.猪不同发育阶段睾丸组织中miR-34b/c及预测靶基因差异表达研究[D].吉林大学,动物遗传育种与繁殖,2013,硕士.
[32]彭艳萍.“闪光菊花炮”反应机理及生产工艺[J].花炮科技与市场.1999(01)
[33]于希宁,牛成林,李建强.基于决策树和专家系统的短期电力负荷预测系统[J].华北电力大学学报,2005,05:59-63.
[34]孔德意.企业文化对企业技术创新机制的支撑[D].东北大学,科学技术哲学,2010,硕士.
[35]郭亚楠.高管继任、团队冲突与企业绩效关系研究[D].内蒙古大学,会计,2014,硕士.
[36]王吉.基于数据仓库的校园管理与决策支持系统的设计[J].科技创业月刊,2004,06:61-63.
[37]胡帅来.面向只读应用的异构信息集成平台的设计与实现[D].苏州大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[38]李九竹.母亲教养方式与5岁儿童的社会退缩的相关研究[D].辽宁师范大学,学前教育,2011,硕士.
[39]赖茜.二维纳米材料与气体相互作用的原位研究[D].暨南大学,2014.
[40]杜江,罗珺.我国农业环境污染的现状和成因及治理对策[J].农业现代化研究,2013,01:90-94.
[41]王戈.对话视野中的高中班级管理[D].河北大学,教育管理,2013,硕士.
[42]周聪.卵巢癌特异性结合肽的筛选及其对卵巢癌生物学行为的影响[D].广州医科大学,妇产科学,2014,硕士.
[43]王继英.在初中英语教学中学案的有效设计及应用研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[44]郭荣伟,王玉振.基于最小驻留时间法估计线性切换系统的分量最终界[J].控制与决策,2012,11:1729-1734.
[45]钦少君.烟台市大众户外运动开展现状及对策研究[D].山东体育学院,运动训练,2012,硕士.
[46]王铭杰.平面光波导与光纤阵列的耦合封装研究[D].大连理工大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[47]夏雨涵.初中生完美主义、能力理论与学业成绩的关系[D].山东师范大学,应用心理（专业学位）,2013,硕士.
[48]郑建兴.钛酸钡基及M型钡铁氧体吸波材料的制备及性能研究[D].中北大学,无机化学,2014,硕士.
[49]廖茂森.盐胁迫下花花柴miRNAs与靶基因相互作用研究[D].新疆大学,生物学,2013,硕士.
[50]陈永丰.高速公路经营模式的比较研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.