肾透明细胞癌中基于MethylCap-seq芯片数据的新侯选基因DNA甲基化谱及其临床价值的研究

【摘要】第一部分MethylCap-seq芯片数据的获得和细胞株中DNA甲基化的筛选目的：对新候选基因的甲基化差异区域在细胞株786-0中进行初步的筛选验证。材料与方法：MethyCap-seq芯片数据的获得本研究基于MethylCap-seq技术的筛选高通量数据来源于复旦大学郭士成博士。RPMI1640培养液培养肾癌786—0细胞并传代,抽取复旦大学附属肿瘤医院组织样本库中肾透明细胞癌配对癌旁组织1例。离心柱法提取DNA。重亚硫酸测序PCR检测目的片段甲基化情况。结果：CD9：正常肾组织中甲基化率84.29%、786-0中甲基化率为88.57%。FBXW10:正常肾组织中甲基化率22.22%,786-0中甲基化率84.44%。HIST1H3E:正常肾组织中甲基化率97.33%,786-0中甲基化率96%。LEP：正常肾组织中甲基化率67.03%,786-0中甲基化率84.32%。SMPD3：正常肾组织中甲基化率35.71%,786-0中甲基化率82.86%。GGT6：正常肾组织中甲基化率94.29%,786-0中甲基化率80%。结论：实验结果表明,FBXW10和SMPD3两基因高甲基化仅发生于786-0中。第二部分SMPD3和FBXW10基因甲基化谱的组织学验证目的：验证FBXW10与SMPD3在肿瘤组织及癌旁正常组织中的甲基化差异。材料与方法：抽取复旦大学附属肿瘤医院组织库中的配对样本。DNA抽提同前。重亚硫酸转化后焦磷酸测序法定量分析甲基化率。结果：共获得配对样本85例。SMPD3基因甲基化率为肿瘤组织48.78%VS癌旁正常组织：34.62%。两者之间有统计学差异(p<0.001)FBXW10基因甲基化率为肿瘤组：58.98%VS癌旁正常组织：38.66%。两者之间有统计学差异(p<0.001)。结论：FBXW10与SMPD3在肿瘤组织中甲基化程度高于癌旁正常组织。第三部分SMPD3和FBXW10基因甲基化谱的临床价值目的：研究FBXW10与SMPD3甲基化率的临床价值。材料与方法：收集85例肾透明细胞癌临床资料。收集资料包括：性别、年龄、肿瘤大小、Fuhrman分级、肿瘤分期。随访通过电话与门诊随访相结合。已病人死亡为随访重点。记录疾病转移及死亡时间。SPSS19.0统计软件(IBM,USA)进行数据分析。结果：癌旁正常组织中SMPD3平均甲基化率与Fuhrman分级有关,FuhrmanⅠ至Ⅳ级平均甲基化率分别为46.88%、36.85%、32.98%、25.71%,具有统计学相关性,p=0.004。随着肿瘤的增大无论肿瘤组织或癌旁正常组织中SMPD3的甲基化率都随之降低癌旁正常组织中更为明显。85例病人中,有20例于术中或随访时发生转移。11例在随访过程中11例死亡,平均随访时间12.6个月(最短3个月,最长32个月)。根据生存状态用ROC曲线法确定癌旁正常组织中甲基化率的最佳分界值,确定26.4%为最佳分界值。定义癌旁正常组织中甲基化率大于26.4%的为高甲基化,小于26.4%为低甲基化。Kaplain-Meir法生存分析显示,高甲基化组平均生存时间为17个月,低甲基化组平均生存时间10个月,二者之间具有统计学差异,p=0.04。48例T1期肿瘤组织平均甲基化率Fuhrman分级成正相关Fuhrman分级Ⅰ至Ⅲ级肿瘤组织甲基化率分别为51.89%,60.37%和66.18%其差异具有统计学差异,p=0.020结论：遗传背景中SMPD3低甲基化提示预后不良。FBXW10在肿瘤组织中的甲基化率可用于提高经皮肾穿刺诊断Fuhrman分级的准确性。第四部分SMPD3和FBXW10在细胞株中的表达及其与甲基化调控的关系目的：研究细胞株786-0去甲基化处理前后SMPD3、FBXW10的表达。材料与方法：在传代细胞中,加入5-aza-dC培养72小时。后收集细胞并提取总RNA。TRIZOL法抽提总RNA。Sybergreen法real-timePCR检测基因表达。结果：SMPD3基因的表达较处理前升高了2.47倍FBXW10基因的表达较处理前升高了1.67倍。结论：目的基因甲基化在基因沉默中发挥重要作用。
【作者】李健；
【导师】叶定伟；
【作者基本信息】复旦大学，肿瘤学，2013，博士
【关键词】MethylCap-seq芯片；重亚硫酸盐测序；甲基化；SMPD3；FBXW10；甲基化谱；临床价值；5’Aza；

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