分娩性臂丛麻痹手内肌与肱二头肌中影响失神经肌肉萎缩进程的蛋白质表达差异的基础研究

【摘要】第一部分大鼠前肢爪内肌和肱二头肌失神经肌肉萎缩进程的形态学研究目的臂丛损伤神经修复术后,失神经手内肌的恢复效果往往远不如肱二头肌、三角肌等上臂大肌肉。在分娩性臂丛麻痹的临床诊治过程中发现,手内肌的萎缩进程明显快于上臂大肌肉,这提示两种肌肉失神经后炎症、凋亡、修复、重建等生物学行为存在明显差异。本部分实验的旨在比较新生大鼠前肢爪内肌与肱二头肌萎缩随失神经时间的动态变化,以阐明两种肌肉失神经萎缩进程不同的形态学依据,为进一步蛋白质表达差异研究提供基础。方法32只新生SD大鼠行右前肢全臂丛撕脱术,并根据术后1、5、10、15周的不同取材时间,随机分成4组,每组8只。在大鼠行肌肉取材前,先将腕部正中、尺神经和入肌点处肌皮神经切片行甲苯胺蓝染色,观察有无因神经交通支原因而出现的神经再生。之后将实验大鼠灌注固定,手术操作显微镜下取出双侧前肢爪内肌与肱二头肌肌肉,均行HE染色、Masson三色染色和TUNEL染色,分别用以观察肌肉萎缩、纤维增生和凋亡的情况。利用图像分析软件,测量实验侧肌纤维的平均截面积,并与对照侧肌纤维截面积进行比较并计算肌细胞平均截面积维持率；测量Masson染色切片的胶原面积与肌肉面积并计算截面积胶原比；利用TUNEL细胞凋亡原位检测法标记切片中的凋亡肌细胞核,每张切片在20倍物镜下连续观察3-5个视野,数至1000个细胞核中凋亡细胞核所占的比例即为凋亡指数。每组数据结果根据分布以中位数(P25-P75)形式表示,应用Wilcoxon符号秩检验爪内肌与肱二头肌之间的差异,所有统计学检验均为双尾检验,检验水准设定为0.05。结果臂丛损伤后各时间点实验侧腕部尺神经和入肌点处肌皮神经均未见有髓神经纤维再生通过。臂丛损伤后5周、10周时肱二头肌肌纤维截面积维持率优于爪内肌,而1周、15周时两者之间的差异无统计学意义；对于肱二头肌胶原比,在臂丛损伤后1周、5周、10周时均小于爪内肌,而在15周时两者之间的差异无统计学意义。臂丛损伤后1周时爪内肌的凋亡指数检测结果大于肱二头肌,并有统计学意义,5周时两者之间无显著差异,10周时爪内肌的凋亡指数结果小于肱二头肌,15周时两者之间的差异无统计学意义。这表明,在失神经早期,爪内肌中的凋亡较肱二头肌活跃,而随着失神经时间的延长,凋亡指数在爪内肌和肱二头肌中均呈先上升后下降的趋势,而爪内肌较肱二头肌更早的进入下降趋势中,最后达到相同水平。结论本实验在形态学上证实了爪内肌在失神经肌萎缩进程中快于肱二头肌,为进一步寻找两者之间蛋白质表达的内在差异提供基础。第二部分应用蛋白质组学技术分析大鼠前肢爪内肌和肱二头肌在失神经肌萎缩进程中的差异表达蛋白质目的在骨骼肌组织中包含大量膜相关蛋白,而且肌蛋白的翻译后修饰各不相同,应用传统生物化学方法研究骨骼肌的生理适应或病理过程中的蛋白质改变十分困难。蛋白质组学作为一种无偏倚的、技术驱动型的研究方法,能够对特定肌组织或肌纤维进行整个蛋白质群的离析、分离与鉴定,是一种具有高效率、高通量特性的分子生物学大规模筛选技术。本实验的目标是,应用8标iTRAQ蛋白质组学技术,筛选并确认大鼠前肢爪内肌和肱二头肌失神经后特异表达的、影响肌萎进程的关键蛋白质,揭示能维持失神经肌萎呈可逆状态的、加速炎症和凋亡等蛋白质与有利于自身修复和重建等蛋白质的组合模式。这最终将为临床上确定对各类肌肉具有共性意义的、失神经肌萎进入不可逆期的检测指标提供理论依据。方法32只新生SD大鼠行右前肢全臂丛撕脱术,并根据术后1、5、10、15周的不同取材时间,随机分成4组,每组8只。在大鼠行肌肉取材前,先将腕部正中、尺神经和入肌点处肌皮神经切片行甲苯胺蓝染色,观察有无因神经交通支原因而出现的神经再生。实验侧和对照侧爪内肌与肱二头肌采用液氮研磨提取法提取蛋白,并使用2-DQuantKit进行蛋白定量。蛋白经纯化、酶解后,用iTRAQ8标试剂进行标记,经高pH反相色谱分离,低pH反相色谱质谱联用进行数据采集及分析,使用ProteinPilot软件进行肽段、蛋白鉴定和定量。对所鉴定的差异蛋白分为爪内肌和肱二头肌两组进行GO和Pathway分析,并对不同时间点的蛋白表达变化趋势进行聚类分析,以确定其在肌萎过程中发挥的功能,筛选出与失神经肌萎缩相关的重点通路和蛋白质。结果应用iTRAQ蛋白质组学鉴定共得到569个蛋白。以1.5倍为差异标准分析得到：在臂丛损伤后1、5、10、15周爪内肌中较肱二头肌表达上调的蛋白质分别为227、71、60、131个；较肱二头肌表达下调的蛋白质分别为58、188、163、34个。经GO分析发现：爪内肌中较肱二头肌表达上调的蛋白质涉及92个细胞组分,其中主要分布于核糖体、细胞骨架、囊泡系统；涉及62个分子功能,其中以分子结合为主；涉及231个生物过程,其中以翻译、细胞死亡或凋亡的调控、肌动蛋白与胶原的形成等生物学过程为主：表达下调的蛋白质涉及87个细胞组分,其中主要分布于收缩纤维、线粒体;涉及61个分子功能,其中以分子结合、转运活动为主；涉及191个生物过程,其中以合成或分解代谢、能量代谢、肌肉收缩等生物学过程为主。Pathway分析发现：前肢爪内肌较肱二头肌表达上调蛋白在蛋白酶体、白细胞跨内皮迁移等16个通路中富集,表达下调蛋白在糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化等18个通路中富集。聚类分析结果显示,臂丛损伤后1—5周的蛋白变化趋势在爪内肌和肱二头肌中均以上升为主；在爪内肌中,5—10周、10—15周时蛋白表达变化趋势为先下降后上升；而在肱二头肌中,5—10周的蛋白变化趋势上升、下降、维持三种情况,10—15周则均为下降。结论爪内肌和肱二头肌在失神经肌萎缩后蛋白质表达存在明显差异。蛋白质合成与降解、炎症反应在爪内肌中较肱二头肌活跃,但能量代谢相关蛋白表达下调；PEBP1等调控MAPK通路的抗凋亡蛋白在肱二头肌失神经早期表达上调并维持在较高水平。
【作者】陈乐滋；
【导师】陈亮；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】手内肌；肱二头肌；失神经肌萎缩；周围神经损伤；蛋白质组学；iTRAQ；

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