甘蓝型油菜隐性纯合两型系的形态学及转录组学分析

【摘要】本实验主要目的是为了研究甘蓝型油菜隐性纯合两型系中雄性不育现象发生的分子机理。由于甘蓝型油菜雄性不育的现象主要与多基因间的互做以及花粉发育等生物途径直接相关。因此,本研究以遗传背景极为相似的甘蓝型油菜隐性纯合两用系WSLA和WSLB为材料,分别对不育系WSLA和可育系WSLB的形态学观察和转录组表达水平两方面进行了综合分析,以解释材料中雄性不育的发生机制。细胞形态学方面主要根据不同的染色剂,在不同时间,不同浓度对材料染色效果的影响等方面进行对比分析,找出一种比较适合观察本材料的切片方法。然后再通过细胞形态学特征判断不育的时期以及花蕾的大小与不同发育时期的关系从而定位不育时期,进而为进一步提取RNA及转录组分析做充分准备。同时也为材料切片的观察做了详细而明确的指导。转录组学方面主要通过分析不育和可育的转录组数据来探究控制其不育的代谢途径以及调控不育的相关基因。并以此为理论基础为今后转基因工程育种奠定坚实的理论基础,同时也为后续基因功能分类提供了重要的参考资料。研究的主要内容如下：(1)WSLA与WSLB的形态学分析：1)在试验过程中,分别对脱水试剂选择及时间、切片厚度和染色剂的选择等方面对条件进行了优化处理,结果表明：叔丁醇的脱水及透明效果优于乙醇和丙酮,脱水最佳时间为30min；切片厚度为10微米时,组织发育的各个时期在显微镜下可以明显辨别；在染色剂选择上运用甲苯胺蓝-伊红双重染色方法的切片,其在显微镜校的图像不但清晰而且明暗效果极佳,特别适合于形态学观察。2)通过显微结构观察分析发现材料花蕾大小与花药各个不同发育时期的相互关系主要表现为：不育材料纵径在1.1～1.6毫米时,花药处于原基发育时期；当纵径在1.6-2.1毫米时,花粉囊中只有极少数花粉；当花蕾纵径在2.1-2.5毫米时,花粉囊无明显分化迹象；当花蕾纵径在2.5-4.7毫米时,花药中的花粉囊始终处于未能分化状态。通过对切片结果和数据的分析比对发现,可以确定材料的双重染色效果最明显。发生不育的时期为小孢子四分体时期,且其所对应的花蕾大小应在1.6-2.1毫米左右。(2)WSLA与WSLB的转录组学分析,通过材料的形态学观察发现具体的败育时期为小孢子四分体时期。因此,我们对WSLA与WSLB四分体时期的花蕾进行了转录组分析,结果表明：测序得到的序列片段(reads)对甘蓝型油菜基因组的覆盖高达125倍,有超过97%的reads是高质量的在基因组上特异匹配的reads。根据RNA-Seq的reads在甘蓝型油菜的基因组及基因上的匹配,绘制了甘蓝型油菜相关序列检测以及表达的相关图谱。通过代表基因转录水平的标准化数据RPKM处理之后,在此基础上再对甘蓝型油菜可育植株和不育植株基因的RNA-Seq数据进行差异表达分析,一共发现2557个差异表达基因(p-value<0.001)。不育材料中转录上调的有1542个,不育材料中转录下调的有1015个,其中花器官特异表达的脂质转运蛋白基因AT5G52160上调非常明显,铜离子转运蛋白相关基因AT3G13400下调也是异常显著,属于拟南芥中的SKS基因家族。另外,与育性相关的基因位点MS1和MS2在可育WSLB中均表现为上调表达,但是表达量很少,说明不育也可能与MS基因位点存在关联性,AT3G51590与AT4G00040为脂肪酸代谢途径的关键基因,在WSLA中均表现为明显下调表达,说明小孢子的败育可能是由于这两个基因调控的绒毡层中脂肪酸代谢紊乱进而导致孢粉素的合成受阻引起。GO基因注释发现差异表达基因中大部分是与转录因子,转运蛋白、脂类及脂肪酸类代谢途径相关,但在上调和下调表达的基因中分别共存在488条和260条基因尚未对其进行功能注释,说明这些基因仍然未进行深入研究。KEGG代谢途径分析表明上调和下调表达的基因中分别存在6条和8条Pathway显著性富集,且分属于不同的代谢途径,说明甘蓝型油菜雄性不育也是一个极为复杂的过程,涉及众多代谢途径的参与调控,因此,通过本研究可分析参与雄蕊败育过程中的基因及所涉及的相关代谢途径,为下一步花药、花粉特异基因等育性相关基因的克隆与功能分析奠定基础,有助于阐明其具体的分子调控机制。
【作者】刘川；
【导师】王瑞；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】甘蓝型油菜；雄性不育；转录组；RNA-seq；差异表达；

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