新型ARB洗脱支架防治支架再狭窄的实验研究及ILKAPs克隆与功能研究

【摘要】背景：经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是目前治疗冠心病的重要方法,但术后再狭窄问题有待解决。新生内膜过度生长是再狭窄的主要原因,与血管平滑肌细胞的过度增殖及分泌细胞外基质有关。血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂(ARB)能抑制内膜增殖,可能是一种新的药物选择。药物涂层支架(DES)是目前治疗PCI后再狭窄的主要方法,常用DES包括雷帕霉素涂层支架(SES)和紫杉醇涂层支架(PES)。两类支架并不能完全消除再狭窄,还会带来支架内血栓形成。改进支架设计、材料、涂层,寻找更合适的药物是解决上述问题的途径。结合血管支架使用基因治疗来调节局部组织细胞功能是一个潜在的方法,但是有关的影响因素和分子机理是该方法进入临床研究前必须明确的问题。目的：为指导临床改进DES用药,我们比较血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂缬沙坦与替米沙坦对离体人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)增殖及胶原分泌的影响并探讨其可能的机制。进一步通过动物实验探讨替米沙坦涂层、缬沙坦涂层和雷帕霉素支架对支架术后内膜增殖的作用差别。探讨影响转基因表达的蛋白sp100的相互作用蛋白,并对可能影响血管支架局部细胞反应的ILKAPs进行基因克隆和功能研究。材料与方法：比较不同浓度的及条件的AngⅡ缬沙坦、替米沙坦、GW9662干预HASMCs的效果。观察处理后细胞增殖能力,细胞上清中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量,细胞AT1、AT2受体蛋白表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平。进一步选取28只实验用猪,随机置入替米沙坦涂层(TES)、缬沙坦涂层(VES)、雷帕霉素支架(SES)和高分子涂层支架(PES)。分别于1周、1月和3月分别处死,处死前进行冠状动脉造影(CAG)、光学相干成像(OCT)检查。通过酵母杂交分析影响基因治疗效果的SP100的相互作用蛋白组成。从中选取可能影响局部细胞增殖的ILKAP作表达谱,基因结构和异构体组成分析。并且通过亚细胞定位、过表达与低调表达对细胞增殖和凋亡的影响来探讨ILKAPs的功能。结果：缬沙坦及替米沙坦均可抑制AngⅡ诱导的HASMCs增殖。替米沙坦的抑制作用较缬沙坦强。缬沙坦及替米沙坦均可抑制AT1受体、促进AT2受体表达,替米沙坦促进AT2受体表达能力更强。缬沙坦及替米沙坦均抑制I、III型胶原mRNA的表达,替米沙坦抑制III型胶原能力较缬沙坦更强。PPAR-y抑制剂GW9662可拮抗吡格列酮对HASMCs增殖的抑制作用,但对替米沙坦抑制HASMCs增殖的作用无明显影响。缬沙坦及替米沙坦对HASMCsⅡ、Ⅲ型胶原的分泌无明显影响。动物实验1周组共5只猪,随访支架13枚。TES、VES、SES和PES较BMS直径狭窄率低。1月组共12只猪,随访支架29枚。CAG结果显示TES、SESSES和PES间MLD和直径狭窄率均有明显差异,其中TES、VES、SES的MLD明显高于PES,直径狭窄率明显低于PES;TES、VES的MLD低于SES,并且TES的MLD高于VES;TES、VES的直径狭窄率高于SES,并且TES的直径狭窄率明显低于VES。OCT检查结果显示TES、VES、SES的新生内膜厚度明显低于PES,面积狭窄率明显低于PES,TES、VES的新生内膜厚度高于SES,并且TES的新生内膜厚度明显低于VES;TES、VES的面积狭窄率高于SES,并且TES的面积狭窄率明显低于VES。3月组共11只猪,随访支架31枚。CAG结果显示TES、VES、SES和PES间MLD和直径狭窄率均有明显差异,其中TES、VES、SES的MLD明显高于PES,直径狭窄率明显低于PES;TES、VES的MLD低于SES,并且TES的MLD高于VES;TES、VES的直径狭窄率高于SES,并且TES的直径狭窄率明显低于VES=OCT检查结果显示TES、VES、SES的新生内膜厚度明显低于PES,面积狭窄率明显低于PES,TES、VES的新生内膜厚度高于SES,并且TES的新生内膜厚度明显低于VES;TES面积狭窄率低于SES和VES。酵母杂交分离到64个潜在的SP100相互作用克隆。其中有ILKAP的一个新异构体出现两次。使用ILKAPORF特异性引物,我们扩增胎脑cDNA文库,从中分离到3个异构体：ILKAP1,ILKAP2和ILKAP3。其中ILKAP1含有两个磷酸酶活性域,ILKAP3含有一个磷酸酶活性域,而ILKAP2仅仅只有一个N端结构域,没有磷酸酶活性域。扫描多组织cDNApannels发现ILKAP2和ILKAP3仅仅在胎脑有较高水平表达。ILKAP3也见于表达于人类心脏。亚细胞定位分析发现ILKAP1-3均定位于细胞质,与ILK具有细胞内共分布特性。提示其存在相互作用的空间可能性。免疫共沉淀分析发现抗GFP的抗体可以沉淀同时表达GFP-ILK的细胞中的三种ILKAPs。过表达ILKAP1、3可以导致细胞划痕愈合时间延长。使用ILKAP特异性shRNA低调细胞ILKAP表达则可以加快划痕愈合。结论：替米沙坦具有比缬沙坦更强的抑制HASMCs增殖、抑制III型胶原基因表达及促进AT2受体表达上调的作用。TES在抑制内膜增殖方面与SES.相似、明显强于VES。SP100可能通过与ILKAP的相互作用参与局部调节。研究提示ILKAP2、3可能与早期发育和心脏功能调节有关。ILKAPs具有负性调节细胞生长的能力。该能力与ILKAPs的磷酸酶活性有关。
【作者】王雷；
【导师】薛京伦；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2011，博士
【关键词】经皮冠状动脉介入治疗；再狭窄；药物涂层支架；主动脉平滑肌；缬沙坦；替米沙坦；血管紧张素Ⅱ；SP100；酵母双杂交；ILKAPs；克隆；

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