山羊RanBP9和CD320基因克隆、组织表达与多态性分析

【摘要】精子介导转基因方法(sperm-mediatedgenetransfer,SMGT)是生产转基因动物的有效途径,具有简便、高效等特点,但机制至今不明确,成了限制这种方法发展运用的瓶颈和世界性难题,造成SMGT存在着极大的随机性和不确定性。目前国际上对此研究较少,且主要集中在CD4分子上。众多蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的,基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。我们前期研究证明CD4分子在山羊精子结合内化外源DNA过程中起到主要作用,并以其为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统,筛选与CD4相互作用的8个候选分子。本研究对其中两个主要的候选分子：RanBP9和CD320,进行基因克隆、序列分析、组织表达与基因多态性分析,为进一步揭示这些候选分子在山羊精子转运外源DNA的作用,深入研究精子介导基因转移的机制奠定基础。RanBP9(Ranbindingprotein9,Ran结合蛋白9)在胚胎干细胞中可以白行发育,且在精子和卵子发生过程中具有重要调节作用。CD320参与体内免疫反应,扮演受体重要角色,能够介导物质和信号的转移与转运。由于在山羊上这两个基因的研究尚属空白,本研究参考GenBank发表的其他物种的序列,在高度保守区域设计特异性引物,通过RT-PCR方法克隆山羊RanBP9和CD320基因,并对其核苷酸序列、氨基酸序列及预测的蛋白质高级结构进行分析。同时,检测RanBP9和CD320基因在山羊不同组织中的表达水平。最后,利用聚合酶链式反应—单链构象多态性(PCR-singlestrandedconformationalpolymorphism,PCR-SSCP)技术,分析CD320基因在大足黑山羊和南江黄羊的遗传多态性。主要结果如下：1.首次克隆了山羊RanBP9基因(GenBank登录号：KF425511.1)和CD320基因(GenBank登录号：KF425510.1),cDNA序列分别为1008bp和517bp。2.RanBP9的开放阅读框(ORF)为936bp,位于2～937bp,编码312个氨基酸残基,在937bp处和2bp分别有加信号；CD320的ORF长459bp,编码153个氨基酸,在463bp处和2bp分别有加信号。采用SMART程序分析表明,.山羊RanBP9氨基酸序列中1-54bp和72-196bp处为未知区域,55-71bp处为低耦合区域,197-299bp处为智能区域；CD320氨基酸序列中100-122bp处为低密度脂蛋白受体结构域,18-56bp处为跨膜区。用BLAST进行序列比对显示,山羊RanBP9基因与恒河猴(Macacamulatta)、大猩猩(Gorilagorilla)、人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和蜥蜴(Japalueabrevipes)的同源相似性都很高,达99％；与牛(Bostaurus)、蟾蜍(Felbufonis)和斑马鱼(Daniorerio)的同源相似性分别为86%、83%和75%；山羊CD320基因与绵羊(Ovisaries)、牛(Bostaurus)同源相似性分别是98%、96%,与海豚(Takifugurubripes)、虎(Pantheratigris).鲸鱼(Orcinusorca).大熊猫(Ailuropodamelanolruca)、马(Equuszebra)和家猫(Pardofelismarmorata)的同源相似性分别是83%、77%、76%、75%、74%和73%。用expasy网站对蛋白疏水性预测,结果显示RanBP9疏水性峰值负值较高,为亲水性；CD320疏水性峰值正值较高,为疏水性。用TMPRED对蛋白进行跨膜性预测,结果显示RanBP9在281-298bp处出现跨膜结构,CD320在103-122处出现跨膜结构,二者均为跨膜蛋白。对两种蛋白进行结构位点分析,显示RanBP9蛋白存在3个N-糖基化位点、2个多糖链接位点和7个蛋白激酶C磷酸化位点；CD320蛋白含有5个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个酰胺化位点和2个异戊烯基结合位点。在NCBI上进行信号肽预测分析,二者均未检测出信号肽。3.采集大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、胰脏、肌肉、睾丸、卵巢和胸腺等组织样品,并提取总RNA,采用半荧光定量PCR的方法检测RanBP9和CD320两个基因组织相对表达量。结果显示RanBP9和CD320在山羊的心、肝、脾、肺、肾、胰脏、肌肉、睾丸、卵巢和胸腺等组织中均有表达,其中RanBP9在睾丸中表达量最高,CD320在脾脏和睾丸组织中表达量较高。4.采集大足黑山羊和南江黄羊血液,样本数均为30只,提取全血DNA,设计特异性引物,利用PCR-SSCP技术,研究CD320基因的遗传多态性。结果显示,大足黑山羊和南江黄羊CD320基因均检测到AA、AB两种基因型,大足黑山羊AA和AB基因型频率分别为0.767和0.233,A、B基因频率为0.883、0.117,He、Ne和PIC分别为0.207、0.667和0.333；南江黄羊AA和AB基因型频率分别为和0.833和0.167,A、B基因频率为0.883和0.117,He、Ne和PIC分别为0.193、1.386和0.204,符合Hardy-Weinberg遗传平衡。
【作者】赵博渊；
【导师】赵永聚；
【作者基本信息】西南大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】山羊；RanBP9；CD320；克隆；组织表达；基因多态性；

【参考文献】
[1]昌中作.基于SaaS模式的公共物流服务平台关键技术的研究[D].北京交通大学,2008.
[2]张玉1,张德伟,周显青.酶催化显色法测定小麦粉中的过氧化钙[J].现代食品科技,2015,05:.
[3]张君.晶振实时测量系统设计[D].南京航空航天大学,电路与系统,2004,硕士.
[4]高兰德.社区电子服务运行支撑平台的设计与实现[D].兰州大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[5]黄适存.左乙拉西坦治疗成人癫痫的临床疗效及安全性[D].苏州大学,神经内科（专业学位）,2014,硕士.
[6]凡颖.云环境下动态资源管理关键技术的研究[D].浙江理工大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[7]孙越.高压下CoSb_3和SmFeO_3的电学性质研究[D].吉林大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[8]本报记者戴华明.托起低碳经济新烯望[N].国际商报,2015-04-08B03.
[9]张媛媛.《百种神秘感觉》中亚裔女性的自我重塑研究[D].河北师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[10]李松涛.一种基于ACS24XS电机驱动器的客车EHPS控制系统[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[11]田美香.基于经济趋同理论的辽宁省经济增长实证研究[D].沈阳理工大学,国际贸易,2012,硕士.
[12]王家声.生产过程控制中的数学模型方法及应用(讲座中)[J].冶金自动化,1980,02:42-56.
[13]郑妮娜.莫尼公司NPI项目经理胜任素质模型构建研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[14]周红.保密散列数字签名及其在信用卡安全中的应用[D].河北工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[15]区锐相.航标无线监控系统及其软硬件设计[D].广东工业大学,机械电子工程,2004,硕士.
[16]铁军,吴智明,柴永成,史生文.铝电解生产数据的OLAP分析[J].计算机与应用化学,2003,Z1:19-22.
[17]颜艳莎.醴陵方言词汇研究[D].河北师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[18]朱相融.阵列式离子液体复合材料气体传感器的构建及应用[D].浙江大学,2015.
[19]王静怡.专利侵权判定原则适用研究[D].甘肃政法学院,经济法学,2012,硕士.
[20]梁胜强.K公司汽车电器产品项目进度管理研究[D].东华大学,项目管理（专业学位）,2014,硕士.
[21]单蒙蒙.企业社会责任对企业价值影响的实证研究[D].浙江财经学院,企业管理,2012,硕士.
[22]张德清.中国农村土地制度创新研究[D].湖南农业大学,农业经济管理,2003,硕士.
[23]杨晓伟.中国居民家庭收入流动性测度研究[D].华中科技大学,西方经济学,2012,硕士.
[24]尚云鹏.社会主义核心价值观的认同机理研究[D].西安科技大学,马克思主义理论,2014,硕士.
[25]李进峰.中国建筑业企业结构分析及调整对策[J].中国社会科学院研究生院学报.2003(05)
[26]包心强.对上海市民办非学历教育机构的政府引导政策研究[D].电子科技大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[27]刘志国,蔡永立,李恺,杨乐,孙灿.常绿阔叶林中栲树展叶期叶片的虫食格局[J].植物生态学报,2009,05:919-925.
[28]周文辉.基于SimMechanics的人体平衡动力学仿真与分析[D].河北大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[29]吴元琴.高粘度酸液酸岩反应动力学参数影响规律实验研究[D].成都理工大学,油气田开发工程,2013,硕士.
[30]曹永青.CSS无线定位跟踪系统的设计与实现[D].河北大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[31]林建成,翟媛丽.“月亮问题”引发的思考——客观性及其根源的理论探讨[J].自然辩证法研究,2014,07:109-113.
[32]李伟.晚清奉天海防炮台建设研究[D].河北师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[33]丁亚辉.钠氢交换抑制剂Cariporide对家兔心房电重构的影响[D].浙江大学,内科学,2004,硕士.
[34]顾飞.基于SPARC架构面向确定性重演的多核访存竞争记录方法的研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[35]张志明.基于水滑石插层材料对类芬顿体系化学发光的研究及其应用[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[36]吕严.基于高通MSM7227平台的Android智能手机设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[37]蒋路飞.横机控制系统的电源设计[D].杭州电子科技大学,集成电路工程,2012,硕士.
[38]冀万芬.翁牛特旗耕地经营权流转问题研究[D].内蒙古农业大学,产业经济学,2013,硕士.
[39]邵小东.城市空间经营：理论模式与实践策略——以西安为例[D].西安建筑科技大学,城市规划与设计,2004,硕士.
[40]窦彩霞.试论民事诉讼当事人处分权[D].中国政法大学,法律,2003,硕士.
[41]刘纯.论陶渊明此生追寻之梦[D].青海师范大学,中国古代文学,2012,硕士.
[42]王珊珊.单通道角跟踪接收机基带信号处理技术[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[43]蔡小井.论持拍隔网对抗项目（乒羽网）中运动技能的迁移[D].扬州大学,体育教育训练学,2011,硕士.
[44]刘倩.DFTA在建筑施工动态安全管理中的应用研究[D].首都经济贸易大学,安全技术及工程,2014,硕士.
[45]蒋宗道.同步电动机的改进型半控励磁电路(上)——论静态半导体励磁系统技术性能的合理设计[J].冶金自动化,1981,03:39-46.
[46]王玲玲.具有时滞的Markovian随机神经网络的稳定性分析[D].燕山大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[47]徐静茹.环境规制对技术创新影响分析[D].江西财经大学,产业经济学,2013,硕士.
[48]张南庆.塔式起重机安全监控系统的研究与实现[D].重庆大学,仪器科学与技术,2014,硕士.
[49]孔申.黑龙江省鸡东金场沟钼矿的成矿地质、地球化学特征与成矿条件分析[D].吉林大学,地质工程,2012,硕士.
[50]赵炜卓.论隐名出资行为的法律规制及立法完善[D].苏州大学,法律（专业学位）,2014,硕士.