阻断CXCL16/CXCR6信号轴减轻心肌缺血/再灌注损伤的机制研究

【摘要】冠状动脉硬化性心脏病,简称冠心病,是目前世界范围内的危害人类健康的第一大杀手,每年有380万男性及340万女性患者死于冠心病。急性心肌梗死发生之后,早期及时的溶栓治疗或者开通血管的PCI术和急诊冠脉血运重建术,是减少心梗面积改善预后的有效的治疗策略。但是恢复缺血心肌的血流,却能造成心肌损伤,加重组织结构破坏,引起细胞死亡,导致梗死范围扩大,造成心功能的进一步损害并影响心梗患者的预后,这一矛盾现象被Jennings在1960年首次报道,并命名为缺血再灌注损伤(Ischemia/ReperfusionInjury,I/RInjury)。炎症,是造成心肌I/R损伤的主要机制。炎症损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程,并且能与钙超载、自由基等其他损伤因素互相渗透,是十分活跃的中介因子。来自基础实验研究的一些证据提示,针对炎症的各种干预措施均可减少心梗面积,最多达50%左右。因此在心肌缺血后再灌注过程中,炎性在各类致损伤机制中起关键作用,可视为各种致损伤因素产生和发展以及对心肌造成损害的中介环节。趋化因子是触发炎症的始动环节。作为新近被鉴定的趋化因子,CXCL16是CXC超家族中的一个非常特殊的成员,是同时具有CC、CXC及CX3C结构特点的趋化因子。CXCL16它与其唯一的受体CXGR6构成一个完整的信号传递轴,它们可能具有更为复杂的生物学功能。目前的研究结果推测,CXCL16/CXCR6信号轴可能的生物学意义在于几个方面：(1)趋化作用,引导CXCR6+细胞的定向迁移；(2)粘附作用,牢固结合CXCR6+细胞,协助细胞间信息的传递；(3)参与细胞因子间的相互作用,如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10等；(4)促血管生成作用。心肌I/R损伤会造成心肌细胞的丢失,既往认为其机制主要涉及心肌细胞的坏死与凋亡(Ⅰ型程序性细胞死亡)。近来的研究认为还有另外一种细胞死亡方式一自噬(Ⅱ型程序性细胞死亡)也参与该过程,且发挥着更为重要的作用。因此,本研究将围绕I/R,趋化因子GXCL16/CXCR6信号轴,心肌自噬等几个方面的相互关系,从一个崭新的角度深入探讨趋化因子CXCL16/CXGR6轴在心肌缺血再灌注损伤中的作用’,以期寻找减少I／R损伤的治疗靶点。本文分为五个部分。第一部分CXCL16在急性ST段抬高型心梗中的变化规律及其临床意义背景：CXCL16与冠心病相关性的研究存在分岐,且在急性ST段抬高型心梗中的作用资料欠缺。研究目的：探讨CXCL16趋化因子在急性ST段抬高型心梗中的变化规律及其临床意义。方法：选取自2011年11月—2012年03月在复旦大学附属中山医院心内科住院并接受冠状动脉造影(CAG)检查的急性STEMI患者共54例,其中32例接受了急诊PCI术(STEMIwithE-PCI组),22例因不符合急诊PCI术的入选标准未行急诊心导管术(STEMIwithoutE-PCI组)。另取同时期CAG检查阴性并排除了冠状动脉痉挛等因素的18例患者,作为对照组(normalCAG组)。距离首发症状的时间点7h,9h,12h,16h,24h,48h,72h(3d),168h(7d)收集静脉血,ELISA法检测血清sCXCL16浓度,并做统计分析。结果：(1)STEMI患者(with/withoutE-PCI)在各个时间点的CXCL16水平均高于normalCAG组；(2)与未行急诊PCI的STEMI患者相比,在首发症状后48小时、72h、168h(7d)三个时间点的CXCL16水平,行急诊PCI的STEMI患者均明显低于前者；(3)在心梗发作后的一周内,行急诊PCI的STEMI患者CXCL16的时间曲线提示高峰提前至16-24h。结论：明确血清CXCL16是反映STEMI炎症水平的重要的生物学”Marker”;急诊PCI可使得STEMI患者血清CXCL16水平高峰前移至心梗后16-24h,此时刻的CXCL16水平并对预后的判断有指导意义。第二部分阻断CXCL16/CXCR6轴能够减轻心肌缺血再灌注损伤并改善心脏功能背景：第一部分的研究结果表明,CXCL16,特别是循环中的可溶性CXCL16(sCXCL16)水平,是反映STEMI炎症水平的重要的生物学“Marker”,对于冠心病预后判断有着重要的临床意义。但是CXCL16/CXCR6轴在I/R中的作用不明。目的：探讨CXCL16/CXCR6轴在心肌缺血再灌注中的生物学作用。方法：培育8周龄CXCR6-/-雄性小鼠及同窝生CXCR6+/+雄性小鼠(背景为C57BL/6J)建立缺血45min及再灌注24h的心肌I/R模型。TTC染色法测定四组(Sham-WT、Sham-KO、IR-WT及I/R-KO)危险区面积(AAR)及心梗面积(IS),小动物心超测定LVEF及LVFS值,小鼠颈动脉插管法测定血流动力学指标,包括+dp/dt,LVEDP,LVSP。小动物PET-CT评估12周龄小鼠再灌48h后的心肌标准摄取值(SUV)。结果：成功培育出数量足够多的CXCR6″’”雄性小鼠及同窝生CXCR6+/+雄性小鼠,同龄的小鼠在外观、静息状态下的各表型没有差别。TTC染色法提示AAR在四组中没有差别,而I/R-KO组的心梗面积(IS)明显低于I/R-WT组小鼠,具体数值为(31.86±1.808%vs.43.09±1.519%,P<0.001;n=6-10pergroup)。小动物心超提示与I/R-WT组小鼠相比,I/R-KO组的LVEF及LVFS均明显改善,分别为:39.65±2.204%vs.32.98±1.525%,P<0.05和20.81±1.001%vs.15.68±0.8257%,P<0.05;n=6-10pergroup。血流动力学结果(IR-WT组vs.IR-KO组,n=6-10pergroup)提示+dp/dt(9910±420.3vs.11366±381.5mmHg/s),LVEDP(13.36±1.349vs.9.741±1.001mmHg)和LVSP(100.6±2.589vs.108.2±3.215mmHg)亦明显改善。小动物PET-CT评估SUV值在IR-KO组明显增加(5.03±0.423vs.1.55±0.357P=0.003,n=4pergroup)结论：阻断CXCL16/CXCR6轴能够减轻缺血再灌注时心肌损伤并能改善心脏功能。第三部分CXCR6缺失通过抑制心肌自噬减少心肌I/R损伤背景：心肌I/R时自噬与心肌细胞的损伤密切相关。在心肌缺血阶段,自噬具有保护心肌的作用,但在再灌注阶段,研究结果不一。目的：1.明确再灌注阶段心肌自噬的水平；2CXCR6缺失减少心肌I/R损伤是否与通过调节心肌自噬有关；3.评估再灌注阶段炎症因子的动态变化。方法：CXCR6-/-及WT雄性小鼠接受假手术或I45min/R24h处理后,应用透射电镜、激光共聚焦及WesternBlot等技术检测心肌中自噬金标准-自噬泡,以及自噬流相关蛋白的表达。Elisa法检测再灌注阶段不同时间点的循环中血清TNF-α、IFN-γ及IL-10等炎症因子的动态变化。结果：电镜发现I/R-KO组中心肌的自噬泡(具有双层质膜的特征性的结构)明显减少(3.272±0.2733%vs.6.8644±0.7467%,P=0.002),激光共聚焦的定性分析发现I/R-KO组中LC3荧光显著降低减少,WesternBlot证实心肌Beclin-1蛋白以及LC3B-II/LC3B-I,P62,CathepsinD等自噬相关蛋白组成的自噬流在I/R-KO组明显下调。再灌注阶段,I/R-WT与I/R-KO两组TNF-α及IL-10水平的动态变化没有明显差别,而IFN-γ再灌注发生后随着时间的延长逐渐升高,且I/R-KO组IFN-γ水平在再灌注6h、12h及24h均低于I/R-WT。结论：自噬在心肌再灌注阶段明显增加,与心肌损伤的程度成正相关,而CXCR6缺失通过抑制心肌再灌注阶段的自噬水平减少心肌I/R损伤。CXCR6缺失的这一保护作用可能与再灌注阶段IFN-γ的水平降低有关。第四部分外源性的IFN-γ逆转CXCR6基因缺失对I/R心肌的保护作用背景：第三部分的结果提示自噬在心肌再灌注阶段明显增加,与心肌损伤的程度成正相关,而CXCR6缺失通过抑制心肌再灌注阶段的自噬水平减少心肌I/R损伤。CXCR6缺失的这一保护作用可能与再灌注阶段IFN-γ的水平降低有关。目的：明确IFN-γ在CXCR6基因缺失以改善心肌I/R损伤机制中的作用。方法：8周龄的CXCR6-/-雄性小鼠在手术前连续三天腹腔注射IFN-γ(100U/g*d),然后建立缺血45min及再灌注24h的心肌I/R模型。采用第二部分的方法,再次使用TTC染色测定四组(Sham+PBS、Sham+IFN-γ、IR+PBS及I/R+IFN-γ)危险区面积(AAR)及心梗面积(IS),小动物心超测定LVEF及LVFS值,小鼠颈动脉插管法测定血流动力学指标,包括+dp/dt,LVEDP,LVSP。结果：TTC染色法提示AAR在四组中没有差别,而I/R+IFN-y组的心梗面积明显大于IR+PBS组小鼠,具体数值为(39.944±1.544%vs.28.71±1.746%,P<0.05；n=6pergroup)。小动物心超提示与IR+PBS组小鼠相比,I/R+IFN-y组的LVEF及LVFS均明显降低,分别为：32.02±1.535%vs.41.96±1.831%,P<0.05和14.74±0.7201%vs.20.41±1.079%,P<0.05;n=6pergroup。血流动力学结果(I/R+IFN-y组vs.IR+PBS组;n=6pergroup)提示+dp/dt(9374±546.0mmHg/svs.11158±458.9mmHg/s,P<0.05),LVEDP(12.97±1.836mmHgvs.8.81±1.274mmHg,P<0.05)和LVSP(87.88±3.824mmHgvs.113.0±5.499mmHg,P<0.05)亦明显加重。结论：外源性的IFN-γ能够逆转CXCR6基因缺失对I/R心肌的保护作用。第五部分再灌注阶段CXCR6缺失导致IFN-γ分泌减少的机制研究背景：文献报道IFN-γ可以触发自噬,自噬也可促使炎症细胞分泌更多的IFN-γ;我们第三部分的研究发现CXCR6缺失可导致IFN-γ分泌减少,进而心肌自噬水平下降,保护了心脏功能。但是心梗再灌注阶段与自噬密切相关的IFN-γ的来源不明确,以及其与趋化因子CXCL16/CXCR6信号轴的之间的分子机制不明。目的：探讨心梗再灌注阶段IFN-γ的来源,以及其与趋化因子CXCL16/CXCR6信号轴的之间的分子机制。方法：应用磁珠法分离8周龄的CXCR6-/-及WT小鼠的脾脏CDllb+脾脏细胞,以3×105/well的数量种植于24孔板,同时将CXCR6-/-及WT的新生小鼠心肌细胞种植于24孔板,CXCL16以100ng/ml的浓度刺激CD11b+脾脏细胞及心肌细胞,48小时后,ELISA法测量细胞上清中的IFN-y的浓度；应用免疫组织化学定性观察及流式细胞计数定量计算I/R后心肌CD1lb+细胞的浸润；CDllb+脾脏细胞与CXCR6-/-及WT的新生小鼠心肌细胞共培养,并接受体外A/R干预后,WesternBlot法测定心肌细胞的自噬水平。结果：CXCL16以100ng/ml的浓度刺激心肌细胞及CXCR6-/-的脾脏细胞,细胞上清IFN-y水平与无CXCL16干预组没有明显变化,而CXCL16干预后的WT的脾脏细胞明显升高,达到1013.10±94.462pg/ml。免疫组织化学及流式细胞结果均发现计算I/R后心肌CD11b+细胞的浸润在I/R-KO组明显减少(4.922±0.698%vs.12.22±1.275%,P<0.05；n=6)。体外共培养实验模拟I/R模型发现,心肌细胞Beclin-1蛋白的表达比未行A/R干预组明显增高。结论：CD11b+炎症细胞而不是心肌细胞是IFN-γ的主要来源；在A/R的条件下,CD11b+炎症细胞浸润可促进心肌细胞自噬的发生。全文总结：1.血清CXCL16在STEMI患者有着特有的变化规律,是反映STEMI炎症水平的重要的生物学“Marker”;起病后16-24h高峰时刻的CXCL16的水平对于行急诊PCI术的STEMI病人的预后判断更有指导意义；2.阻断CXCL16/CXCR6轴能够减轻缺血再灌注时心肌损伤并能改善心脏功能；3.阻断CXCL16/CXCR6轴通过抑制心肌再灌注阶段的自噬水平减少心肌I/R损伤；4.CXCR6缺失的这一保护作用可能与再灌注阶段IFN-γ的水平降低有关；5.CD11b+炎症细胞是IFN-γ的主要来源,在A/R的条件下,CD11b+炎症细胞浸润可促进心肌细胞自噬的发生。
【作者】赵刚；
【导师】葛均波；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】CXCL16；CXCR6；心肌缺血再灌注损伤；自噬；

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