小热休克蛋白alpha B-Crystallin(Cryab)在肝癌侵袭转移中的分子机制及与索拉非尼耐药研究

【摘要】肝细胞肝癌(以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一,我国每年肝癌死亡30余万人,占世界50%以上,肝癌晚期患者5年内的生存率只有7%,即使根治性肝癌切除后5年内复发转移率高达40%-70%。转移与复发是导致患者死亡的主要原因。因此,探索肝癌侵袭转移与复发的发生机制、寻求有效的抗肝癌转移与复发治疗策略,对改善肝癌患者预后具有重要意义。近年来,小热休克蛋白(smallheatshockprotein,sHsp)在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视。研究证实其可通过参与细胞增殖、分化及凋亡等过程在肿瘤发生与发展中扮演重要角色。目前关于sHsp在肿瘤中的作用研究主要集中在Hsp27与肿瘤进展的关系。如复旦大学肝癌研究所(我所)研究显示,Hsp27在高转移性肝癌细胞中高表达,且下调Hsp27水平可抑制肝癌细胞转移。aB-Crystallin(Cryab)也是一种sHsp,主要存在于晶状体,故又称晶状体蛋白。最近研究提示其在肿瘤细胞中呈高表达,且有可能成为潜在的癌基因。结合在人胚胎发育过程中的Cryab表达呈现时间与空间差异,提示其可能在胚胎发育中重要精确调控作用。故我们拟探索Cryab在肝细胞癌中Cryab的表达、与肝癌转移与复发的关系及分子机制,以期为抑制肝癌转移与复发提供新的治疗靶点。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是上皮细胞通过特定的程序转化为间质样细胞的生物学过程,在胚胎发育、创伤愈合、肿瘤的侵袭转移等过程中起重要作用。目前,EMT在恶性肿瘤的侵袭转移病理过程中的分子机制已成为研究热点,尤其是消化道肿瘤方面。由于上皮性肿瘤在恶性肿瘤中所占比例较大且预后较差,因此,探究上皮肿瘤细胞发生EMT的机制,可为肿瘤复发的预防和治疗提供方向。细胞发生EMT的特征就是上皮表型基本消失,细胞变形失去彼此之间的连接,极性丧失,且迁移能力增强。新近的研究表明,肿瘤细胞在发生EMT过程中可获得干细胞潜能,产生凋亡和免疫耐受。索拉非尼(sorafenib)是一种新型多靶点抗肿瘤药物,能够抑制ERK(细胞外调节蛋白激酶,extracellularregulatedproteinkinases)信号传导系统Raf、抑制血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)和血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorbetareceptor,PDGF-(3R)等酪氨酸激酶受体而抑制肿瘤进展,但其临床效果不一。有研究提示Cryab过表达可诱导ERK1/2组成性激活及肿瘤的EMT。在此我们利用基因芯片和生物信息学探索Cryab促进肝癌侵袭与转移复发的分子机制；应用免疫共沉淀结合液相质谱分析、RNA干扰分子生物学技术等确定Cryab促肝癌侵袭转移的信号通路后,我们进一步研究Cryab表达与肝细胞癌患者索拉非尼疗效之间的关系。第一部分Cryab表达与肝细胞肝癌转移和复发研究目的：研究小热休克蛋白Cryab在不同转移潜能肝癌细胞系的差异表达,初步分析其表达与肝癌转移能力的关系；上、下调Cryab表达,研究其对肝癌细胞侵袭与转移能力的影响；研究Cryab在肝癌组织中表达,探讨其临床预后意义。方法：应用荧光定量PCR、westernblot与免疫荧光方法检测不同转移潜能肝癌细胞系中Cryab表达；构建Cryab干扰/过表达慢病毒载体,转染肝癌细胞,构建稳定细胞株；利用细胞侵袭实验研究Cryab表达改变前后肝癌细胞侵袭能力改变情况,利用裸鼠原位模型研究Cryab表达改变前后肝癌细胞成瘤能力及转移能力的变化；采用组织芯片结合免疫组化检测403例肝癌组织中Cryab蛋白表达,生存分析统计肝癌组织Cryab表达与患者临床预后关系。结果：荧光定量PCR、westernblot与免疫荧光方法检测结果显示,Cryab在高转移性细胞系HCCLM3中高表达,在低转移性细胞系Bel-7402和Hep3B中低表达。成功构建Hep3B-Cryab(上调Cryab表达)和HCCLM3-vshCryab(下调Cryab表达)细胞。体外实验显示干扰Cryab表达肝癌细胞侵袭能力下降；同样上调Cryab表达后,肝癌细胞的成瘤能力及转移能力增强。临床研究显示,高表达Cryab肝癌患者预后比低表达Cryab肝癌患者差,多因素分析示Cryab表达是肝癌总生存率和无瘤生存率的独立预后因素。结论：Cryab表达程度与肝癌细胞系的侵袭转移潜能明显相关,Cryab过度表达与肝癌的侵袭、转移及不良预后相关。第二部分Cryab促进肝细胞肝癌上皮间质转化及索拉非尼耐药机制研究目的：探讨Cryab过表达促进肝癌细胞侵袭及转移的机制。方法：通过比较HCCLM3-Mock、HCCLM3-vshCryab、Hep3B-Mock与Hep3B-Cryab四种细胞形态和表型特征、以及全基因mRNA表达水平等,探讨Cryab过表达促进肝癌细胞侵袭与转移的机制。细胞实验分析Cryab过表达与索拉非尼耐药的关系,进一步分析Cryab表达与肝癌患者索拉非尼治疗效果的关系。结果：高表达Cryab的Hep3B-Cryab和HCCLM3-Mock细胞呈现为梭形,而低表达Cryab的Hep3B-Mock和HCCLM3-vshCryab细胞呈鹅卵石样,细胞之间连接紧密。PCR、westernblot及细胞免疫荧光检测显示在高表达Cryab细胞中E-cadherin表达下调,而vimentin、F-actin表达上调,且slug高表达及核内聚集。原位裸鼠肝癌模型及临床组织进一步研究显示过表达Cryab促进肝癌EMT发生。Cryab高表达通过上调ERK1/2磷酸化水平而诱导肝癌细胞EMT。同时,索拉非尼不能有效地抑制高表达Cryab细胞中ERK1/2磷酸化,且高表达Cryab细胞增殖能力比对照组强。临床预后资料分析显示Cryab高表达肝癌患者索拉非尼治疗效果比低表达Cryab肝癌患者差(p=0.011)。结论：Cryab过表达通过诱导肝癌细胞EMT而促进肝癌细胞侵袭及转移及索拉非尼抵抗。第三部分Cryab促进肝细胞肝癌上皮间质转化信号通路研究目的：探索小热休克蛋白Cryab诱导肝癌细胞发生EMT的信号通路。方法：应用免疫共沉淀、质谱分析等技术及生物信息学筛选与Cryab相互作用蛋白,通过siRNA、信号转导抑制剂等确定Cryab诱导肝癌细胞发生EMT的信号通路。分析403例肝癌根治性切除患者中Cryab及其相关蛋白表达与预后的关系。结果：免疫共沉淀结合液相质谱和生物信息学分析筛选出10个Cryab相互作用蛋白：CYFIP1、FASN、GSTP1、HSP90、HSPB1、IQGAP1、PCNA、PRKDC、ACTN4和14-3-3(；在高表达Cryab的肝癌细胞中,利用siRNA干扰以上10种分子的mRNA,只有干扰14-3-3(可明显降低ERK1/2磷酸化,下调高表达Cryab肝癌细胞中14-3-3ζ表达后可明显降低ERK1/2磷酸化,上调肝癌细胞E-cadherin表达,下调vimentin、fibronecitin1(Fn-1)及N-cadherin和核转录因子slug表达。进一步研究分析Cryab结合14-3-3ζ可抑制14-3-3ζ蛋白降解。Cryab通过结合14-3-3ζ,激活ERK1/2/Fra-1/slug信号通路而诱导肝癌细胞EMT。临床研究发现Cryab和14-3-3ζ共高表达的患者预后最差。结论：Cryab与14-3-3ζ形成功能复合体,激活ERK1/2/Fra-1/slug信号通路而诱导肝癌细胞EMT。
【作者】黄晓勇；
【导师】周俭；
【作者基本信息】复旦大学，肝外科，2013，博士
【关键词】Cryab；肝细胞肝癌；上皮间质转化；EKR；索拉非尼；

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