颠茄ODC基因克隆和功能分析

【摘要】颠茄(AtropbelladonnaL.)是茄科颠茄属多年生草本,为重要的药用植物。其主要次生代谢产物托品烷类生物碱(TropaneAlkaloids,TAs)包括莨菪碱和东莨菪碱,作为抗胆碱药物而广泛运用,市场需求十分巨大。托品烷类生物碱在植物中含量很低,其产量远远不能满足市场需求。化学合成困难且昂贵,难于大规模生产。近年来,随着托品烷类生物碱合生物合成途径研究越来越深入,许多下游途径中相关基因己被克隆和鉴定,使得通过基因工程手段提高植物中TAs含量成为可能。然而对于TAs生物合成上游途径研究较少,特别是TAs前体腐胺的生物合成并不清楚。本文采用分子生物学和生物化学方法研究腐胺的生物合成,以期阐明TAs上游合成途径中重要酶促反应步骤分子机理,并为遗传改造颠茄TAs生物合成途径提供候选功能基因。本研究基于已有EST测序结构,采用RACE技术从颠茄中首次克隆获得腐氨合成途径中的两个鸟氨酸脱羧酶(OrnithineDecarboxylase,ODC)基因,分别命名为AbODC1和AbODC2。生物信息学分析结果显示,AbODC1基因cDNA的物理全长1527bp,其中包含长为1293bp的编码区,编码430个氨基酸残基的多肽:AbODC2基因cDNA的物理全长1312bp,其中包含长为1194bp的编码区,编码397个氨基酸残基的多肽。相比于AbODC1表现出与其他茄科植物鸟氨酸脱羧酶的高相似性,AbODC2与其他茄科植物鸟氨酸脱羧酶及AbODC1的相似性较低,与来源于茄科植物、动物和细菌的ODC在发育进化树上独成一支,显示AbODC2与目前已报导的ODC亲缘关系较远。信号肽和转运肽预测显示,AbODC1和AbODC2都属于胞质蛋白,且主要定位于细胞质中。二级结构预测AbODC1包含33.26%的α-螺旋、18.60%B-片层和48.14%随意卷曲构成；AbODC2包含34.76%的α-螺旋、14.86%p-片层和50.38%随意卷曲构成。三级结构预测显示AbODC1和AbODC2蛋白都具有鸟氨酸脱羧酶典型结构,且与已报道的烟草ODC蛋白三级结构空间结构相似；AbODC1蛋白还具有与烟草ODC蛋白完全相同的底物结合位点,而AbODC2与烟草ODC蛋白的底物结合位点有一定差异。利用hiTAlR-PCR技术克隆得到颠茄AbODC基因的基因组DNA序列,结果表明AbODC1和ＡbODC2都不存在内含子。启动子分析表明AbODC1和AbODC2分别存在3处和2处分值大于0.8的可能基础启动子区域,其上游区域都可能存在光响应、厌氧响应元件,同时AbODC1还可能存在赤霉素和MeJA响应元件；AbODC2可能存在ABA响应元件。以pET28为载体,在大肠杆菌Rosetta中诱导表达,对AbODC1基因进行原核表达功能验证,经0.5mMIPTG诱导18℃培养6h,收集纯化AbODC1重组蛋白,其分子量约接近预测的46.5Kda。以L-ornithine为反应底物,在磷酸吡咯醛存在下,检测AbODC1重组蛋白的催化活性,利用HPLC法检测到腐氨生成,表明本研究AbODC1确实具有鸟氨酸脱羧酶的功能。遗憾的是,本研究未能获得可溶性AbODC2重组蛋白质,未能对AbODC2功能进行鉴定。采用携带发根诱导质粒pRiA4的卸甲根瘤农杆菌C58C1侵染颠茄叶片,成功获得颠茄发根。用100mMNaCl、UV-B和低温分别处理悬浮培养的颠茄发根,检测AbODC1和AbODC2基因表达量,并测定多胺的含量。结果表明,无论是NaCl处理还是UV-B处理,精胺和亚精胺的含量都得到了极大的提高,显示了多胺与植物抗各种生物与非生物胁迫有着密切的关系,且多胺含量的提高可能是因为ODC基因表达量的提高。然而除了NaCl处理12h时,其他NaCl时间点及UV-B所有时间点腐胺的含量都没有显著的变化,这可能是因为大量的腐胺被用于合成精胺和亚精胺。通过Q-PCR检测显示,AbODC1基因的表达量在各种处理时并没有提高反而显著降低,有趣的是AbODC2基因在各种处理时都具有显著的提高,尤其是在4h,其基因表达量都是对照的2倍以上。因此,可能是AbODC2而不是AbODC1对非生物胁迫条件下腐胺的合成起主要作用。不同组织AbODC基因相对表达量的结果显示,AbODC1特异性的在根器官(须根和主根)中表达量最高,其次是花器官中的花萼、花蕾和花蕊,嫩叶中表达量最低；AbODC2基因的表达非常特异,几乎只在须根中表达,由于根是合成生物碱主要的组织。因此推测AbODC2基因可能与生物碱的合成有着密切的相关性。以pCAMBIA1305(P1305)载体作为超量表达载体,成功构建了在颠茄中超量表达AbODC1和AbODC2的重组质粒：P1305-AbODC1和P1305-AbODC2。以PHINNIBAL为中间载体,PBIN19为表达载体,构建得到RNA干扰导致AbODC1和AbODC2基因沉默的重组质粒：1’BIN19-AbODC1和PBIN19-AbODC2。将四个重组质粒分别转入农杆菌C58C1,获得工程菌：C58C1-P1305-AbODC1、C58C1-P1305-AbODC2、C58C1-PBIN19-AbODCl和C58C1-PBIN19-AbODC2。本研究成功克隆得到鸟氨酸脱羧酶家族中两个基因,并对其分别进行功能分析。这对于研究腐胺的生物合成具有重要作用,并为遗传改造颠茄TAs生物合成途径提供候选功能基因。
【作者】秦白富；
【导师】廖志华；吴能表；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】颠茄；鸟氨酸脱羧酶；发根；诱导处理；多胺；

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