基于DNAzymes构建电化学生物传感器检测生物小分子
【摘要】生物传感器是由生物、医学、物理、化学、电子技术等多种学科相互渗透形成的新的研究领域。生物传感器在临床医学、环境监测和食品工业等方面都有重要应用,并以其体积小、特异性好、灵敏度高、检测快速方便、检测成本低和容易实现实时在线活体检测等优点,成为当前科学研究的热点之一。近年来新的分子生物学技术不断涌现,并在科学研究和实际应用中得到不断的发展和完善,使生物分子检测的灵敏度和特异性都得到很大的提高。然而随着疾病诊断要求的不断提高与科学研究的不断深入,迫切需要发展一些灵敏度高、选择性好、操作简单且成本低廉的生物传感器以便更好地满足科学研究和实际应用的需求。本研究主要利用核酸酶(DNAzymes)的自剪切特性以及核酸切刻内切酶N.BstNBI的性质来循环放大电化学检测信号,从而提高新设计的生物传感器的灵敏度；通过借助T4DNA连接酶对其辅因子的高度依赖性以及核酸酶(DNAzymes)对其催化自剪切辅因子的特异性识别能力来提高新设计的生物传感器的选择性。本研究的主要内容如下：(1)基于酶连接反应和自剪切核酸酶信号放大双重策略构建新型电化学生物传感器。讨论了基于辅因子ATP依赖性的酶连接反应和自剪切核酸酶(8-17DNAzyme)信号放大双重策略设计的电化学生物传感器对于目标分子三磷酸腺苷(ATP)的检测效果。连接反应生成的活性8-17DNAzyme在Zn2+存在时,能够剪切与其杂交的发卡结构DNA基底,使标记了亚甲蓝的基底片段离开金电极表面,从而产生可检测的电化学信号。由于T4DNA连接酶对辅因子ATP具有高度的特异性,当检测系统中不存在目标分子ATP时,两段独立的DNA片段不能被连接成一条完整的8-17DNAzyme序列,后续的自剪切催化反应就不能发生。因此,此传感器对ATP的响应具有高度的选择性。连接反应产生的8-17DNAzyme能够循环放大自剪切所产生的电化学信号变化,增强传感系统的灵敏度,使得此传感器对于ATP的检测限达到0.053nM(S./N=3)。(2)基于特异性DNAzyme和核酸切刻内切酶N.BstNBI构建新型电化学生物传感器。主要讨论了基于特异性DNAzyme和核酸切刻内切酶N.BstNBI信号放大双重策略构建的新型电化学生物传感器对于目标分子L-组氨酸的检测效果。当体系中存在目标分子L-组氨酸时,L-组氨酸依赖性的DNAzyme则在其腺嘌呤核糖核苷酸(rA)酶切位点发生相应的自剪切催化反应,导致DNAzyme在rA酶切位点处发生断裂,因而游离出一段DNAzyme残片与固定在金电极表面的HP-FcDNA发生杂交反应,在电极表面形成能被核酸切刻内切酶N.BstNBI特异性识别的DNA双链。当体系中加入核酸切刻内切酶N.BstNBI时,在其特异性识别序列的酶切位点处就会发生催化剪切反应,使HIP-FcDNA发生断裂,导致标记有二茂铁的DNA碎片从电极表面游离出去,从而产生可检测的电化学信号。由于此DNAzyme对其辅因子L-组氨酸具有高度的依赖性,所以此传感系统对目标分子L-组氨酸的检测具有超高的选择性。核酸切刻内切酶N.BstNBI参与的酶切反应过程能够进行多圈循环,产生循环放大电化学检测信号的效果,增强检测系统的灵敏度,使得此传感器对于L-组氨酸的检测限达到360nM(S/N=3)。(3)基于DNAzyme、核酸切刻内切酶N.BstNBI、标记的短链DNA探针构建signal-on型电化学生物传感器。主要讨论了基于特异性DNAzyme、核酸切刻内切酶N.BstNBI、亚甲蓝标记的短链DNA探针构建的signal-on型电化学生物传感器对于目标分子L-组氨酸的定量检测效果。为了提高传感器对于目标分子L-组氨酸检测的灵敏度,在同类型的signal-off传感系统中加入亚甲蓝标记的短链DNA探针,从而将其改进为一个新型的signal-on型电化学生物传感器。改进后的传感器对L-组氨酸响应的线性范围为5.0×10-7-1.0×10-3M(线性相关系数为0.995),检测限达到0.21μM(S/N=3)。与之前报道的文献相比,这个新型的signal-on型电化学生物传感器在一定程度上提高了对于目标分子L-组氨酸检测的灵敏度。
【作者】路璐；
【导师】李念兵；
【作者基本信息】西南大学，物理化学，2014，硕士
【关键词】电化学生物传感器；DNAzymes；核酸切刻内切酶；三磷酸腺苷；L-组氨酸；
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