MicroRNA-218经ROBO1通路调控胰腺癌侵袭和淋巴道转移的实验研究

MicroRNA-218经ROBO1通路调控胰腺癌侵袭和淋巴道转移的实验研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-25 分类:期刊论文 喜欢:3874
师大云端图书馆

【摘要】目的寻找胰腺癌淋巴道转移相关的miRNAs,研究目标miRNA调控胰腺癌侵袭和迁移的机制,及其体内抑制胰腺癌淋巴道转移的效应。方法(1)采用miRNA表达谱芯片分别对PDAC与癌旁正常组织之间,以及胰腺癌高转移细胞克隆BxPC-3-LN与亲代胰腺癌细胞株BxPC-3之间的差异miRNAs进行筛选;荧光定量PCR验证目标miRNA在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达;分析miRNA表达与临床病理因素间的关系;原位杂交实验以明确miRNA在PDAC、IPMN和癌旁正常石蜡组织中的原位表达特点;荧光定量PCR和WesternBlotting实验来检测miRNA-218的靶基因在胰腺癌组织中的表达。(2)采用miRNA-218类似物Mimics-218瞬时转染胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN,上调细胞中miRNA-218的表达,研究miRNA-218对靶基因ROBO1的调控作用;通过荧光素酶基因报告实验以确定miRNA-218与靶基因ROBO1的调控位点;慢病毒Lenti-218稳转上调细胞中miRNA-218表达后,用质粒pcDNA3.1瞬时转染3’-UTR缺失的ROBO1以恢复该细胞内ROBO1的表达,通过Transwell侵袭实验和迁移实验研究miRNA-218是否通过ROBO1调控胰腺癌细胞的侵袭和迁移活动;免疫荧光实验检测miRNA-218调控后细胞骨架的变化;CCK-8实验和平板克隆形成实验研究miRNA-218对胰腺癌细胞增殖的影响。(3)采用Lenti-218稳转后miRNA-218表达上调的BxPC-3-LN细胞,在BALB/C裸小鼠上建立人胰腺淋巴道转移模型,研究体内环境中miRNA-218对胰腺癌淋巴道转移和生长的影响。结果(1)通过miRNAs表达谱研究,发现胰腺癌组织中有70个差异表达的miRNAs(相对于癌旁正常组织),胰腺癌高转移细胞克隆BxPC-3-LN中有63个差异表达的miRNAs(相对于亲代胰腺癌细胞株BxPC-3细胞),miRNA-663、miRNA-145、miRNA-218和Let-7在胰腺癌和细胞克隆BxPC-3-LN中均出现异常表达,其中miRNA-218表达下降且差异最大(差异倍数>10);荧光定量PCR检测发现miRNA-218在胰腺癌组织(P=0.001)和胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN中(P<0.001)均表达下降;胰腺癌发生淋巴结转移的病例,其原位癌组织中miRNA-218的表达相对更低(P=O.003);胰腺癌细胞内的miRNA-218表达相对正常胰腺腺泡细胞和导管上皮细胞低,胰腺癌淋巴结转移灶内癌细胞的miRNA-218表达更低。miRNA-218靶基因ROBO1在胰腺癌组织中表达升高(P=0.0066),其蛋白质表达相对癌旁正常组织也明显升高。(2)胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN中Mimics-218瞬时转染24hr、48hr和72hr后miRNA-218表达均明显升高(P值分别为<0.001、<0.001和0.001),并抑制了ROBO1mRNA的表达(P值分别为0.002、0.002和0.006)和蛋白质的表达,miRNA-218与ROB01相互作用的位点在ROBO13’-UTR区域,长度为8个碱基(971-978):Lenti-218稳转胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN后,miRNA-218表达上调抑制了ROBO1mRNA表达(P=0.002)和蛋白质表达,细胞的侵袭和迁移能力受到抑制(P值均<0.001),pcDNA-muROBO1瞬时转染细胞后,逆转了miRNA-218的表达抑制作用使ROBO1表达上升(P<0.001),细胞的侵袭和迁移能力相对提高(P值均<0.001):miRNA-218表达升高导致细胞骨架密度下降以及细胞分布松散;miRNA-218高表达细胞的增殖能力受到缓慢的抑制,克隆形成率下降(P=0.004)。(3)Lenti-218转染组和Lenti-NC转染组细胞接种BALB/C裸小鼠爪垫2周后成瘤,两组肿瘤对动物体重的影响无差异;接种肿瘤40天后实验终止,Lenti-218转染组原位癌体积较Lenti-NC转染组小(P=0.001):Lenti-218组胭窝淋巴结转移阳性率较Lenti-NC组低(P=0.007),Lenti-218组腹股沟淋巴结转移阳性率与Lenti-NC组无显著差异(P=0.108),两组裸小鼠髂动脉旁淋巴结均未检获阳性淋巴结,Lenti-218组总淋巴结转移率与Lenti-NC组无显著差异(P=0.083)。结论(1)miRNA-218在胰腺癌组织和胰腺癌高转移细胞克隆BxPC-3-LN中表达下降,miRNA-218下游靶基因ROBO1在胰腺癌组织中表达升高,两者呈负调控关系;(2)胰腺癌细胞克隆BxPC-3-LN中miRNA-218具有抑制ROBO1表达的作用,miRNA-218与ROBO1的调控位点明确;(3)miRNA-218通过ROBO1通路调控胰腺癌细胞侵袭和迁移;(4)miRNA-218体内对胰腺癌的淋巴道转移和生长均有抑制作用。
【作者】何航;
【导师】傅德良;
【作者基本信息】复旦大学,外科学,2013,博士
【关键词】胰腺癌;侵袭;淋巴道转移;小分子非编码核糖核酸;ROBO1基因;

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