材料表面拓扑形貌的细胞响应以及PLGA组织工程多孔支架的制备与软骨组织修复研究

【摘要】软骨缺损修复是再生医学领域非常有挑战性的一个课题。组织工程学的出现,将可能使人们从传统的器官移植和植入这种以伤补伤的方法进入到一个器官制造的新时代,其为软骨缺损修复提供了新的思路和方法。软骨组织的损伤或者缺损往往会伴随软骨下骨的改变,近年来,采用双层支架来模拟关节软骨和软骨下骨各自内在结构和生理功能以实现软骨和软骨下骨的同时修复成为一个新思路,但关于双层支架的很多基本问题还有待于进一步探索。未来生物材料的设计需要对于材料的细胞响应有深入的认识。近几十年来的相关研究已经大大加深了人们对于“生物材料”涵义的理解,同时也提供了更多探索的方向。材料的诸多因素可以影响细胞行为,其中,表面形貌的效应普遍存在,并且由于形貌改变可不涉及化学成份的改变,故相应的材料改性容易最终获得批准应用。本博士论文以聚乳酸—羟基乙酸共聚物(PLGA)这种有应用价值的可降解高分子为基质材料,开展了生物医用材料方面的研究。论文首先从二维平面探索微米拓扑形貌的细胞响应行为并得出基本规律,继而将其应用于三维多孔支架中,最后再用组织工程双层支架进行关节软骨和软骨下骨同时修复的动物实验。该研究有助于理解材料物理因素对于细胞的作用,为生物材料设计提供指导。本论文的主要创新性工作包括以下几方面：1.制备了一系列不同尺寸的微米阵列,研究其细胞响应行为,并发现适合骨髓基质干细胞黏附的尺寸。本论文在二维PLGA膜表面制备了一系列不同高度(深度)的微柱(微坑)阵列,然后研究骨髓基质干细胞在这些拓扑形貌表面的生长情况。根据实验结果,我们发现1μm高度(或深度)的微柱(或微坑)阵列相对于其它高度(或深度)的阵列更利于细胞的生长。进一步我们比较了1μm微坑和1μm微柱,发现1μm微柱比微坑和光滑膜更适合骨髓基质干细胞的黏附。2.利用材料表面微柱阵列实现了对于细胞核严重自我变形的调控。本论文工作过程中,意外发现新生大鼠骨髓基质干细胞细胞核在特定高度的PLGA微柱阵列表面能发生严重自我变形；细胞核变形并非是由细胞核的重力作用引起的,而可能是由细胞铺展时的内应力导致；尽管骨髓基质干细胞发生了如此严重的细胞核变形,其仍具备增殖和成骨分化的能力。本文通过设计不同微柱阵列,成功控制了细胞核的形状,在国际上首次实现了哑铃形、方形、十字交叉等异常细胞核形状。此外进一步研究了另外五种细胞(Hela、PC12、NIH3T3、MC3T3、Chondrocyte),发现细胞在微柱阵列表面的细胞核变形现象具有普适性；同时其响应程度具有细胞类型依赖性。3.通过设计新型致孔剂实现了三维PLGA多孔支架内部孔结构以及孔壁拓扑形貌的控制。基于粒子浸出技术,首次通过对石蜡球致孔剂表面物理修饰的办法调控了组织工程支架内表面微米拓扑形貌。在石蜡球这种致孔剂粒子表面通过氯化钠粒子的撞击制备出微米尺寸的凹坑,然后再把这些微米拓扑形貌转移到三维多孔支架孔表面,从而获得微米凸起结构。三维多孔支架中的这些微米凸起能促进新生SpragueDawley(SD)大鼠骨髓基质干细胞的黏附,同时并不影响干细胞的增殖和分化。此外,还首次发明“糖粘盐”这种新型致孔剂,使得制备得到的组织工程支架具有规则的球形孔形状以及良好的连通性,并且孔表面具有微米拓扑形貌。制备得到的组织工程多孔支架利于SD大鼠骨髓基质干细胞的生长。这些研究成果为组织工程和再生医学中的材料设计提供新的视野和技术。4.设计了PLGA双层多孔支架,并通过合作研究,探讨了支架物理参量对于体内关节软骨修复效果的影响。在动物实验之前,本论文按照国家标准“医疗器械生物学评价”的相关要求设计了PLGA支架材料体内外的生物相容性实验,并研究了其在新西兰大白兔体内的降解行为。通过实验,发现PLGA支架材料细胞毒性小,血液相容性好,且不会在骨/软骨缺损处引起明显的炎症反应,同时具有合适的降解速率。另外,制备了双层支架以修复新西兰大白兔骨/软骨缺损,并首次实现对双层支架中各层最优孔隙率、孔径探索。设计并制备好双层支架后,通过合作研究,将PLGA双层支架植入新西兰大白兔骨/软骨缺损处(直径4mm,深度5mm),以检验各组支架对其修复效果。术后12周,从大体观、H&E染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色、组织学评分和相关基因的表达这些结果中我们得出：软骨段支架孔隙率为92%,骨段支架孔隙率为77%的双层支架及软骨段孔径为100-200μm,骨段孔径为300-450μm的双层支架能实现比其它孔隙率或孔径组合更好的修复效果。除了上述工作以外,在“复旦大学博士生短期国际访学资助计划”资助下赴美国密歇根大学进行为期4个月短期交流期间,我还合成了两组分的聚酸酐,并研究了其表面溶蚀性能、制备了药物释放装置。
【作者】潘震；
【导师】丁建东；
【作者基本信息】复旦大学，高分子化学与物理，2013，博士
【关键词】组织工程；再生医学；组织修复；聚乳酸-聚羟基乙酸；拓扑形貌；微柱阵列；细胞黏附；细胞增殖；细胞分化；细胞核；细胞核形状；干细胞；多孔支架；致孔剂；生物相容性；体外实验；体内实验；骨/软骨缺损；癌细胞；聚酸酐；药物释放；

【参考文献】
[1]党纯,贾芙蓉,高本领,王必本.催化剂对类石墨烯纳米片结构和发光性能的影响[J].发光学报,2015,01:57-62.
[2]彭美霞.当代中国马克思主义意识形态面临的挑战与对策研究[D].广东财经大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[3]赵云松.HT教育集团企业文化建设研究[D].安徽大学,工商管理,2013,硕士.
[4]蔡磊.乙酰丙酸绿色高效制备方法研究[D].浙江大学,化学工艺,2004,硕士.
[5]杨彬.益肾助阳活血化浊法治疗多囊卵巢综合征的临床疗效观察[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[6]张小芳.母语为英语的留学生动宾式离合词使用偏误分析及汉语教学[D].西安外国语大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[7]杨倩玫.肥厚型心肌病人左心房功能的超声研究[D].遵义医学院,影像医学与核医学,2012,硕士.
[8]吕高桥.高中语文课堂的文学接受活动研究[D].华中师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[9]冯丹.无乳链球菌GlnR因子的原核表达及其与DNA的相互作用研究[D].广西科技大学,生物化工,2013,硕士.
[10]韩艳萍.聚丁二酸丁二醇酯（PBS）共聚聚酯的合成与性能研究[D].华东理工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[11]姜媛.时间距离对风险决策的影响机制[D].苏州大学,应用心理学,2013,硕士.
[12]张宇.基于”双峰”时效热处理的氢对7075铝合金力学行为影响的研究[J].热加工工艺,2015,06:159-161.
[13]张国宝,黄金才,马伟叁,金祖德.沪宁线7分钟追踪运行后区间通过能力的研究[J].上海铁道科技.2002(02)
[14]崔思达.旧城更新改造中邻里交往空间规划研究[D].天津大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[15]毛瑞雪.基于数据血缘的审计证据追踪技术研究及应用[D].哈尔滨工程大学,计算机软件与理论,2012,硕士.
[16]王晨.自拟金柴疏胆汤治疗肝郁脾虚型慢性胆囊炎的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医内科学（专业学位）,2014,硕士.
[17]王凡.河北省城镇化水平和速度的实证分析[D].河北大学,区域经济学,2014,硕士.
[18]谢萍生.基于改进层次分析法的低碳建筑影响因素分析研究[D].广东工业大学,结构工程,2013,硕士.
[19]王勋志.基于UHF局部放电监测系统软件设计[D].西安电子科技大学,无线电物理,2012,硕士.
[20]强学红.Hesse流形的截面曲率及共形变换[D].山西师范大学,基础数学,2013,硕士.
[21]陈奇福,吴敏,安剑奇,王昌军.模糊PID控制在高炉炉顶压力控制系统中的应用[J].冶金自动化,2010,02:10-14+37.
[22]孟庆虎.全域极光特征提取及亚暴事件研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[23]彭美红.吸毒行为入罪问题研究[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[24]张文.程颢思想与生态美学建构的中国资源[D].山东大学,文艺学,2013,硕士.
[25]谌姿.加入WTO后中国农业的发展：优势及对策[D].中国农业大学,农村区域发展,2004,硕士.
[26]杨柳.时滞网络控制系统的分析与控制[D].东北石油大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[27]张立学.城轨车辆称重找平方法的理论研究与软件实现[D].西南交通大学,车辆工程,2013,硕士.
[28]张旭.双氢青蒿素对人卵巢癌细胞株HO-8910凋亡作用的实验研究[D].山西医科大学,妇产科学（专业学位）,2013,硕士.
[29]丁晓杰.我国湿地生态补偿法律制度研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[30]郝晓飞.中国《涉外民事关系法律适用法》中合同法律适用原则研究[D].哈尔滨工业大学,国际法学,2013,硕士.
[31]庄俊梅.内部控制与会计信息价值相关性的实证研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[32]张文良.低铜铁基钎料低真空钎焊不锈钢油冷器试验研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[33]沈菲,王洪礼,冯剑丰,孙景.知识发现在赤潮预测预警系统研究中的应用[J].海洋技术,2003,02:19-22.
[34]马立玲,杨英华,王福利.一类基于神经网络非线性观测器的鲁棒故障检测和诊断[J].控制与决策,2003,03:309-312+316.
[35]徐海,樊太亮,赵夏,翟立新,张翊孟,杨剑,韩瑞冬.基于矢量中值滤波的ISS高密度地震数据去噪方法[J].石油地球物理勘探,2013,03:340-344+506+325.
[36]熊麟,鲁若愚.基于R&D溢出的集中研发联盟合作行为[J].控制与决策,2014,01:172-180.
[37]姚红.RhoB在慢性粒细胞白血病细胞与原始造血细胞中的功能研究[D].苏州大学,免疫学,2012,硕士.
[38]YueYan.The Analysis of C-E Translation of Legal Texts under Functionalist Translation Theory[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[39]卿硕.不同品牌体验媒介对绿色农产品消费者品牌信任的影响研究[J].商业时代,2014,10:64-67.
[40]刘权.陕西省高速公路工程项目合同管理存在的问题及对策[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[41]郑静静,印兴耀,张广智.基于Curvelet变换的多尺度分析技术[J].石油地球物理勘探,2009,05:543-547+521-522+650.
[42]李冰.莫兰迪绘画中形的意义和形与形之间的关系[D].河北师范大学,美术,2014,硕士.
[43]刘国强.县级职教中心“校企合作”的困境与对策研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[44]柴轶男.寿光市农业推广服务体系模式创新研究[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[45]蒋嗣韬.基于Graphene条带的纳米结构电学传输性质研究[D].南京邮电大学,2013.
[46]刘志骅.关于人大代表协助法院调解的分析与完善[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[47]戴闻韬.箭根薯和圆叶大黄的活性成分研究[D].北京中医药大学,中药化学,2014,硕士.
[48]颜斌.化疗联合负载自体抗原致敏的DC-CIK治疗多发性骨髓瘤的临床疗效及免疫学机制研究[D].川北医学院,内科学,2013,硕士.
[49]曲永印,白晶,周振雄,王忠礼,邵世煌.自适应逆控制的异步电机变频调速系统研究[J].控制与决策,2007,07:821-824.
[50]王林.制备工艺与氮化硅显微结构及性能的相关性[D].西北工业大学,材料学,2004,硕士.