PLGA双层支架负载骨髓间充质干细胞修复兔膝关节骨软骨缺损

【摘要】第一部分PLGA双层多孔支架的设计、制备及其生物相容性目的：制备不同孔径孔隙率PLGA双层支架及其生物相容性研究。方法：采用室温模压/粒子浸出法制备上下层不同孔径孔隙率双层支架。将聚乙交酯-丙交酯(PLGA)溶于二氯甲烷后与不同粒子大小的氯化钠晶体致孔剂(氯化钠粒子大小范围有50-450μm)或不同质量比的氯化钠致孔剂混合,然后填入预制的模具中模压成型24h,脱模以后,得到柱状的混合物。不同粒子大小致孔剂或不同含量致孔剂的柱状混合物通过二氯甲烷粘合起来,然后裁剪成特定的尺寸。将致孔剂用去离子水浸出以后,即得到所需的双层支架。同时将分离培养获得的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种于PLGA双层支架,体外培养1周后扫描电子显微镜观察。结果：成功获得直径4mm、高度5mm的PLGA双层多孔支架,其中不同孔径的5种,不同孔隙率的3种。所有支架上层高度1mm、下层高度4mm。电镜观察示支架孔的形态良好,孔与孔之间相通,上下层整合一体且相互连通。BMSCs接种于支架体外培养后,细胞在所有支架的孔壁上黏附良好,可见细胞外基质沉积。结论：室温模压／粒子浸出法可制备不同孔径孔隙率的PLGA双层支架,且PLGA双层支架生物相容性良好。第二部分PLGA双层支架不同孔径对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响目的：探讨一体化PLGA双层支架负载骨髓间充质干细胞修复兔膝关节骨软骨缺损的可行性,了解不同孔径双层支架对骨软骨缺损修复效果的影响。方法：采用室温模压／粒子浸出法以PLGA为原料制备5组不同孔径的一体化双层多孔支架,致孔剂粒子大小范围为50-450μm。来自新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs)用荧光染料DiI标记后,以1×106/20μl接种于双层PLGA支架的软骨层,体外共培养1周,制成双层PLGA支架-细胞复合物,并在电镜下观察。接种细胞或相应未接种细胞的双层支架植入兔膝关节骨软骨缺损模型(直径4mm,深度5mm)。于术后6周和12周取材行大体观察、组织学评分及免疫组织化学染色观察。术后6周标本一分为二切开,部分标本做冰冻切片,DAPI复染,荧光显微镜下示踪BMSCs。另外,12周标本一分为二切开,取-半行realtime-PCR检测基Ⅰ胶原(CollagentypeⅡ,ColⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan,AGC)及Ⅰ型胶原(CollagentypeⅠ,ColⅠ)三种基因相对表达水平。结果：成功获得5种不同孔径PLGA双层支架(孔径大小范围为50-450μm)。电镜观察示BMSCs在支架内生长良好。术后6周,荧光显微镜下观察见Dil标记的细胞存活于缺损区。12周大体观察显示支架B(软骨层孔径100-200μm、骨层孔径300-450μm)负载细胞修复的组织表面光整,新生组织和周边界限不清,质地接近正常组织；其他支架植入物都有不同程度的修复,但差于接种细胞的支架B。组织学评分显示负载细胞的支架B组评分最低,和其他支架组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后12周免疫组织化学染色示负载细胞的支架B标本软骨区ColⅡ及软骨下骨区ColⅠ表达均强阳性。另外,12周后负载细胞的支架B组CoiⅠ基因表达水平最高,和其他植入物比较差异均有统计学意义(P<0.05)。尽管负载细胞的支架B组AGC的表达水平最高,但各组间无明显统计学差异(P>0.05)。ColⅠ表达水平支架B和支架D(软骨层孔径300-450μm、骨层孔径100-200μm)间有明显差异(P<0.05),其他组之间比较无明显统计学差异(P>0.05)。结论：一体化PLGA双层支架负载BMSCs支持软骨及软骨下骨的同时再生其中软骨层孔径100-200gm、骨层孔径300-450μm的PLGA双层支架修复效果最好。双层多孔支架的不同孔径对骨软骨缺损修复效果有影响。第三部分PLGA双层支架不同孔隙率对兔膝关节骨软骨缺损修复效果的影响目的：探讨不同孔隙率PLGA双层支架负载BMSCs修复兔膝关节骨软骨缺陨的可行性,分析不同孔隙率双层支架对骨软骨缺损修复的影响。方法：筛选粒子大小为200-300μm的氯化钠晶体致孔剂,和PLGA按不同质量比混合,采用室温模压/粒子浸出法制备3组不同孔隙率的一体化双层多孔PLGA支架。然后对不同孔隙率3种支架行机械力学性能检测。用DiI标记BMSCs,以1×106/20μl接种于双层PLGA支架的软骨层,体外共培养1周,制成双层PLGA支架-细胞复合物,并在电镜下观察。将接种细胞或相应未接种细咆的双层支架植入兔膝关节骨软骨缺损模型(直径4mm,深度5mm)。于术后6周和12周取材行大体观察、组织学评分及免疫组织化学染色观察。术后6周标本一分为二切开,部分标本做冰冻切片,DAPI复染,荧光显微镜下示踪BMSCs。另外,12周标本同样一分为二切开,取一半行realtime-PCR检测相关基因表达水平。结果：成功获得3种不同孔隙率PLGA双层支架,孔隙率范围为77%-92%,孔径大小范围均为200-300μm。力学性能结果显示支架A(软骨层孔隙率92%、骨层孔隙率77%)应力应变曲线有两个斜率,而支架B(软骨层、骨层孔隙率均为85%)和C(软骨层孔隙率77%、骨层孔隙率92%)只有一个斜率。支架A软骨层的压缩模量E1：3.8±1.1MPa,骨层压缩模量E2：29.1±5.0MPa。支架B压缩模量为16.1±3.2MPa,支架C骨层压缩模量为0.7±0.2MPa,软骨层未检测出。电镜检测显示BMSCs在支架内生长良好。术后6周,荧光显微镜下观察见Dil标记的细胞存活于缺损区。12周大体观察显示支架A负载细胞修复的组织表面光整,新生组织和周边界限模糊,质地接近正常组织；其他支架植入物都有不同程度的修复,但差于接种细胞的支架A。组织学评分(最高总分值减去所评分值)显示接种细胞的支架A组评分最高,和支架C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周免疫组织化学染色示接种细胞的支架A组软骨区ColⅡ及软骨下骨区ColⅠ表达均强阳性。另外,12周后新生组织基因表达水平显示接种细胞的支架A组ColⅡ基因表达水平最高,和支架C组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。尽管接种细胞的支架A组Coll和蛋白聚糖表达水平较其他组更高,但各组间无明显统计学差异(P>0.05)。结论：不同孔隙率PLGA双层支架负载BMSCs支持软骨及软骨下骨的同时再生,其中软骨层孔隙率为92%、骨层孔隙率77%的PLGA双层支架修复效果最好。双层多孔支架的不同孔隙率对骨软骨缺损修复效果有影响。
【作者】段平国；
【导师】董健；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】兔；BMSCs；PLGA；双层支架；生物相容性；孔径；骨软骨缺损；孔隙率；

【参考文献】
[1]俞（王争）.胎儿单纯性轻度侧脑室扩张症与其神经系统发育情况的关系[D].浙江大学,妇产科学,2004,硕士.
[2]张军霞.牧鸡干扰下草地蝗虫群落多样性与空间异质性的研究[D].西北师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[3]刘佳.辛伐他汀上调高脂饲养的ApoE-/-小鼠胆固醇逆向转运相关因子的表达[D].扬州大学,病理学与病理生理学,2011,硕士.
[4]宗慧敏.具有共振的分数阶微分方程边值问题解的存在性[D].河北科技大学,数学,2014,硕士.
[5]兰兴旺.石墨烯基复合物的制备及其催化性能研究[D].南京理工大学,2013.
[6]吕亚楠.石墨烯的制备及缺陷修补[D].湖南师范大学,有机合成,2013,硕士.
[7]黄小兰.基于决策树的分类算法及实现[D].西南石油学院,2003.
[8]储晓韵.骨髓细胞学图像分析报告系统的建立及其应用[D].浙江大学,生物医学工程,2004,硕士.
[9]包乃兰.基于嵌入式PC104的矿山监测系统设计与开发[D].河北工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[10]于杨.超高压技术对葱叶酱品质及安全性影响的研究[D].齐鲁工业大学,食品科学,2014,硕士.
[11]谢明.喷射沉积内氧化颗粒增强铜基复合材料的制备及其组织性能研究[D].昆明理工大学,材料学,2014,博士.
[12]崔艺馨.基于本体的制造资源服务化及其能力平衡优化方法[D].哈尔滨工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[13]韩文英.超声造影与增强CT在肾肿瘤鉴别诊断中的对比研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[14]石书济.我国卫星测控系统发展概况及几点建议[J].电讯技术.1992(02)
[15]李梅花,喻玺,周海波,潘浩.基于TCS3200的多路颜色采集系统设计[J].新技术新工艺,2014,12:26-29.
[16]崔耸.Zr-Cu非晶合金薄膜的制备与研究[D].燕山大学,材料学,2013,硕士.
[17]洪丽萍.国有土地上房屋被征收人权利保护研究[D].华侨大学,民商法学,2014,硕士.
[18]范隽瑜.合作学习在高职基础英语教学中的实践研究[D].华东师范大学,学科教学,2012,硕士.
[19]丁军玲.中等职业学校班主任幸福感的调查研究[D].鲁东大学,教育管理（专业学位）,2013,硕士.
[20]汤冠琼,秦皓,李林,林宇震,李继保.非定常条件下喷嘴结构对燃油流量脉动的影响[J].航空动力学报,2015,04:831-837.
[21]柴玉璞.从化极算法误差方程看各种波数域低纬度化极方法[J].石油地球物理勘探,2012,03:496-505+360+518.
[22]郑超.众线程宽向量体系结构建模与性能分析[D].国防科学技术大学,电子科学与技术,2012,硕士.
[23]梁飞.基于安全多方协议的电子商务隐私保护协同计算研究[D].广东工业大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[24]田海宾.宋代进奏院研究[D].河北大学,中国古代史,2014,硕士.
[25]张文生,张关泉,宋海斌.基于混合法波场外推的波动方程基准面校正[J].石油地球物理勘探,2001,02:141-145+186-262.
[26]马强.论中学历史作业的布置[D].华中师范大学,历史教学,2013,硕士.
[27]欧腾.中南石油勘探集团公司财务管理体系优化设计[D].中南大学,工商管理,2004,硕士.
[28]陈珍.基于交通源与综合运网组合变化的路网交通能耗影响研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[29]何纯莲.百合中秋水仙碱的分离应用研究[D].湖南大学,化学工程,2003,硕士.
[30]吴艳.融资型中小企业俱乐部方案设计[D].中南林学院,林业经济管理,2004,硕士.
[31]王丹丹.甘蓝型油菜遗传图谱构建及苗期耐旱相关性状的QTL定位[D].西南大学,作物遗传育种,2014,硕士.
[32]孙志鹏.基于QP-nano的汽车ABS功能模拟软件系统设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[33]宋慧.梯度材料夹层在圆柱形压头作用下的接触问题[D].内蒙古工业大学,力学,2013,硕士.
[34]刘瑶.品特剧作中的权力主题[D].兰州大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[35]郑伟.浅谈企业竞争情报系统的建立[J].安徽冶金,2005,01:60-62.
[36]施娟.数学师范生实践课程的调查研究[D].扬州大学,基础数学,2012,硕士.
[37]彭臻.我国公共卫生发展市场化问题研究[D].山东财经大学,社会保障学,2014,硕士.
[38]张培彦.基于白刚玉微粉的SiC单晶片（0001）C面化学机械抛光研究[D].南京理工大学,机械工程,2012,硕士.
[39]刘冬.人工神经网络在电器优化设计中的研究[D].沈阳工业大学,电机与电器,2004,硕士.
[40]陈云芳,王汝传,柯行斌.基于用户行为分析的入侵检测应用模型的研究[J].微机发展,2004,02:121-124+127.
[41]余鹏.农村双向物流供应链模式的研究[D].江西财经大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[42]赵月根.按电势定向的异步电机交交变频矢量控制系统[J].冶金自动化,1995,03:28-32.
[43]夏慧敏.基于亚波长光栅的新型光伏电池抗反射层研究[D].安徽大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[44]唐梅.巨灾风险主体行为特征及影响因素研究[D].西南大学,金融学,2013,硕士.
[45]侯凤娇.河北省涞源县浮图峪—小立沟铜（铁）矿床矿物特征研究及成矿机制[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[46]杨鹏.列车通信网络远程输入输出模块研究[D].北京交通大学,2014.
[47]王玉霞.不同林地经营模式的特征、影响因素和绩效分析[D].南京农业大学,土地资源管理,2013,硕士.
[48]刘成立.当代大学生思想政治教育人本旨归论[D].东北师范大学,思想政治教育,2014,博士.
[49]吕磊.基于OTN技术实现广电网络三网融合的应用[D].西安工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[50]袁欣.基于网络视角的并购协同研究[D].北京交通大学,2013.