凡纳滨对虾生长性能相关候选基因的分离鉴定、表达规律及调控功能研究

【摘要】凡纳滨对虾在我国水产养殖业中占有十分重要的地位，近些年，其养殖的面积和产量逐步上升，带动了我国经济的发展。但是由于亲本培育不规范，筛选不严格，近亲繁殖现象普遍，育苗技术不规范等原因，种苗质量严重下降，主要表现在：生长速度慢，个体生长差异大。据此，深入开展凡纳滨对虾生长相关基因的研究，探索其生长发育的分子调控机制，是实现优质、高效养殖的关键基础。本研究采用基因表达谱差异筛选及候选基因法分离鉴定了与凡纳滨对虾生长性能相关的7个候选基因，并对其进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR研究了各基因mRNA时空表达规律；利用原核表达技术成功表达并纯化了相关蛋白，并采用Western-blot技术进一步检测了筛选所得在mRNA水平差异表达基因于蛋白水平的表达情况；利用RNA干扰技术沉默了各候选基因，探索了相关基因之间表达关系并检测了对虾部分表型特征，初步鉴定出各基因对生长相关性状的可能调控途径，获得的主要研究结果如下：1.利用GeneFishingTM技术结合实时荧光定量PCR法获得3条在同一全同胞家系3月龄体重差异极显著（P<0.01）的两组凡纳滨对虾（大虾组与小虾组）腹部肌肉组织中差异表达序列，分别为凡纳滨对虾actinT23’端部分cDNA序列、核糖体蛋白L18基因(RpL18)以及小核核糖核多肽G基因(SNRPG)同源序列，此3条序列在大虾腹部肌肉组织中的表达显著（P<0.05）高于其在小虾腹部肌肉组织中的表达。采用同样的方法获得5条于同一全同胞家系1、3及6月龄凡纳滨对虾腹部肌肉组织中差异表达序列，分别为凡纳滨对虾细胞增殖核抗原(PCNA)、热休克蛋白90(HSP90)、2型肌球蛋白重链(MYH2)及钙蛋白酶B(CalpB)3’端部分cDNA序列以及核糖体蛋白L7基因(RpL7)同源序列，此5条序列在3月龄凡纳滨对虾腹部肌肉组织中表达量最高。2.采用同源克隆等方法成功获得了上述差异表达基因RpL18、SNRPG、RpL7及凡纳滨对虾生长性能相关的其他候选基因肌肉生长抑制素/生长分化因子11(MSTN/GDF11)、蜕皮激素受体(EcR)、维甲类X受体(RXR)及E75cDNA序列，其中EcR含有8种转录本，RXR含有2种转录本。上述各序列均包含完整的编码区。采用不同生物信息学软件及在线程序对上述基因所编码蛋白的序列及结构进行分析及预测，获得的主要结果包括：甲壳动物RpL18、SNRPG及RpL7蛋白高度保守；MSTN/GDF11N端的糖基化位点“PNMTG”、前肽与成熟肽之间的酶切割位点“RXXR”及C端的9个半胱氨酸残基在各物种中高度保守；EcR、RXR及E75的保守位点包括P-box、D-box及C2C2锌指蛋白DNA结合基序中8个半胱氨酸残基；各物种蛋白序列构建的进化树表明甲壳动物相关蛋白的距离较近，在进化树中聚为一分枝，尤其以对虾序列的相似度最高，在进化树中距离最近；RpL18含有一个蛋白磷酸化位点，其序列为“KRLFMPRVHRPPIALSKV”，位于第49-66个氨基酸之间；MSTN/GDF11具有信号肽序列，两个明显的跨膜螺旋及一个TGFβ结构域；EcRa、RXRa及E75各含一个ZnF_C4结构域及HOLI结构域，且E75含两个明显的跨膜螺旋。3.采用实时荧光定量PCR法对上述RpL18、SNRPG、RpL7、MSTN/GDF11、EcR、RXR以及E757个基因mRNA表达规律进行了研究。各基因mRNA组织分布表明：RpL18、SNRPG及RpL7在腹部肌肉中表达水平最高；MSTN/GDF11在头胸部肌肉及心脏中表达水平高于其他组织；EcR在头胸部肌肉、卵巢及表皮中的表达高于其他组织；RXR在头胸部肌肉、卵巢、表皮、心脏及步足中表达量高于其他组织；E75在腹部肌肉、头胸部肌肉及眼柄中表达量高于其他组织。各基因mRNA发育时序表达谱表明：RpL18、SNRPG、RpL7及MSTN/GDF11在仔虾中表达高于其在早期幼体中表达且RpL7及MSTN/GDF11在受精卵中表达较高；EcR、RXR以及E75mRNA在受精卵及无节幼体时期表达量较低，从蚤状幼体开始其mRNA表达水平比较稳定且高于发育早期。各基因mRNA在一个蜕皮周期中的表达表明：在腹部肌肉组织中，RpL18、SNRP及RpL7mRNA在蜕皮间期的表量最高，MSTN/GDF11mRNA主要在蜕皮后早期表达；在肝胰腺、表皮及腹部肌肉组织中EcR及RXRmRNA主要在蜕皮前期表达；在肝胰腺及表皮中，E75mRNA在蜕皮前期表达较高，而在腹部肌肉组织中E75在蜕皮周期各阶段恒定表达。4.将凡纳滨对虾RpL18、SNRPG及RpL7基因编码区及MSTN/GDF11成熟肽（MSTN/GDF11-MP）序列插入至pET32a(+)中构建了各基因的原核表达载体；在大肠杆菌BL21中成功表达并采用不同方法纯化了带组氨酸标签的RpL18、SNRPG、RpL7及MSTN/GDF11-MP融合蛋白；进一步利用Western-blot技术检测RpL18及SNRPG蛋白在同一全同胞家系3月龄体重差异极显著（P<0.01）凡纳滨对虾腹部肌肉组织中的表达发现，RpL18及SNRPG在大虾中表达水平高于其在小虾中的表达水平；在蛋白水平上检测RpL7于同一全同胞家系不同月龄凡纳滨对虾腹部肌肉组织中的表达情况表明，RpL7在3月龄的表达水平最高，其次为1月龄，在6月龄表达最低。5.利用体外转录方法成功制备了RpL18、SNRPG、RpL7、MSTN/GDF11、EcR、RXR及E757个基因的双链RNA，将其分别注射入凡纳滨对虾体内能有效沉默上述各基因mRNA在对虾体内的表达。沉默RpL18、SNRPG及RpL7，肌肉生长标志基因Actin与MHCmRNA表达水平均随之下降。对以上3个基因以及核糖体蛋白家族另一成员QM(RpL10)之间表达关系研究显示：沉默RpL18，QM与RpL7mRNA的表达水平上升，而SNRPGmRNA的表达下降；沉默SNRPG，QM与RpL7mRNA的表达上升，而RpL18mRNA的表达水平下降；沉默RpL7，QM的表达降低，而SNRPG及RpL18mRNA水平上升。推测RpL18、SNRPG、RpL7及QM在功能上是相互联系的，通过基因间的协同或互补共同参与正向调控凡纳滨对虾肌肉生长。沉默MSTN/GDF11，肌肉生长标志基因Actin与MHCmRNA表达水平升高，同时肌肉生长相关调控基因Akirin、Follistatin及cdk2mRNA表达上调，表明在凡纳滨对虾MSTN/GDF11具负调控其肌肉生长的功能，此调控作用可能是通过MSTN/GDF11负调控Akirin、Follistatin及cdk2mRNA的表达而得以实现。RNAi下调EcR、RXR及E75mRNA的表达后，肝胰腺中蜕皮相关基因组织蛋白酶L(CHSL)及血蓝蛋白(HCyn)、表皮中几丁质代谢相关基因几丁质合成酶(ChS)与几丁质酶2(Chi2)、肌肉中肌肉生长标志基因Actin与MHC以及上述各组织EcR、RXR及E75mRNA表达水平均发生特异性变化，对虾累积蜕皮率降低，形态异常，死亡率增加。向对虾体内注射蜕皮激素(20E)后，各组织中EcR、RXR及E75以及肝胰腺中CHSL及HCyn，表皮中ChS及Chi2，肌肉中Actin与MHCmRNA的水平也显示出特异性变化。据此推测，凡纳滨对虾EcR、RXR及E75被体内20E激活后可介导多种信号途径对其蜕皮、几丁质代谢及肌肉生长等多种生理功能具有重要的调控作用。
【作者】钱昭英；
【导师】刘小林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，水生生物学，2014，博士
【关键词】凡纳滨对虾；分子克隆；表达；RNAi；生长；

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