肺炎链球菌肽聚糖水解酶LytB与耐药相关蛋白Sp0010的结构与功能研究

【摘要】I.肺炎链球菌肽聚糖水解酶LytB的结构和功能研究肺炎链球菌是人类的主要致病菌之一,它能导致重大人类疾病并造成每年一百六十多万人的死亡。研究证据显示肺炎球菌的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶LytB对肺炎链球菌的细胞分裂以及细菌在鼻咽部定植发挥重要作用,然而LytB的生化分子机制到目前为止还不清楚。我们解析了LytB催化结构域(残基从375位赖氨酸至658位天冬氨酸)的晶体结构(以下简称为LytB其衍射分辨率为1.65A。LytBCAT由三个结构相对独立的模块SH3b、WW和GH73组成,这三个模块组成一个“T”字型沟槽构成了其催化活性中心。蛋白质三维结构比较结合计算模拟显示LytB的底物为四糖五肽,其催化关键残基为Glu564。体外酶活水解实验表明蛋白LytB更易于水解敲除基因lytB肺炎链球菌中的肽聚糖,这暗示了LytB的特异性底物为未成熟肽聚糖。结合体外长链分散实验和体内细胞分裂分析,我们证明了SH3b、WW和GH73三个模块对于蛋白LytB活性都是必需的。进一步的功能分析显示LytB的完整活性对于肺炎链球菌粘附和侵染人的肺上皮细胞是非常关键的。基于结构的序列比对,我们发现LytB这种特殊的结构模块组成方式在链球菌Streptococcusmitis和Gemella的同源蛋白中高度保守。我们的研究结果阐明了LytB在肺炎球菌细胞壁重构和细菌粘附侵染过程中发挥功能的分子机制,为新型抗生素和疫苗的开发提供了理论基础。II.肺炎链球菌耐药相关蛋白Sp0010的结构和功能研究肺炎链球菌能导致患者具有极高死亡率的原因是很多肺炎链球菌具有多重耐药性。革兰氏阴性菌和阳性菌常常利用p-内酰胺酶来抵抗p-内酰胺类抗生素,然而到目前为止肺炎链球菌中还没有β-内酰胺酶被鉴定出来。我们合作者提供的实验数据表明在肺炎链球菌TIGR4中将编码一个推测为p-内酰胺酶的基因Sp0010敲除后,肺炎链球菌对多种抗生素敏感。.因此,我们表达和纯化了这个蛋白进行结晶研究,并收集了一套2.5A分辨率的野生型蛋白Sp0010数据。通过肽聚糖结合实验,我们证明了蛋白Sp0010能够结合肺炎链球菌的肽聚糖。通过生物化学与结构生物学方法研究蛋白Sp0010的结构与功能将最终揭示蛋白Sp0010介导肺炎链球菌抵抗多种抗生素的分子机理。
【作者】柏晓辉；
【导师】陈宇星；周丛照；
【作者基本信息】中国科学技术大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】肺炎链球菌；内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶；晶体结构；GH73结构域；细胞壁重构；肽聚糖；致病性；β-内酰胺酶；抗生素；多重耐药性；

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