调控IFN-γ的microRNA筛选及作用机制研究

【摘要】免疫系统是生物体抵抗外来微生物入侵的第一道防线,干扰素是免疫应答过程中的重要效应因子。Interferon-γ(IFN-y)属于Ⅱ型干扰素,主要由活化的T淋巴细胞、NK细胞产生,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用,特别是对胞内寄生菌的感染具有显著抑制效果。microRNA(miRNA)是一类广泛存在于生物体内且长度在18-25bp之间的非编码RNA。近十年来,大量研究表明miRNA参与对机体免疫系统的调控,对维持机体的免疫稳态起着举足轻重的作用。本研究选取重要的免疫细胞因子IFN-y作为研究对象,利用生物信息学方法和生物学实验,对可能参与调控IFN-y表达的miRNA进行了筛选和验证,希望通过本研究能够系统阐述miRNA对IFN-y表达多层次的调控机制,加深对miRNA调控IFN-y介导的免疫应答过程中作用机制的认识,同时为进一步开发miRNA作为疾病诊断和治疗的新靶标提供理论依据。具体研究内容包括以下几个方面：1.靶向IFN-y启动子及其3’UTR的miRNA的预测利用在线miRNA预测软件Microinspector和TargetScan分别对IFN-y转录起始位点上游的1197bp序列及3’UTR的583bp序列进行分析,预测到可能靶向IFN-y启动子区域的miRNA50条,可能靶向IFN-γ3’UTR的miRNA11条。根据miRBase公布的miRNA序列信息,从预测结果中选取8条可能靶向IFN-γ启动子区域的miRNA和10条可能靶向3’UTR的miRNA合成mimics及inhibitors。2.报告质粒的构建将PCR扩增获得的IFN-γ转录起始位点上游的1197bp片段和3’UTR的583bp片段分别连接到pGL3-Basic和pMIR-REPORT载体上,成功构建了IFN-γ启动子报告质粒pGL3-TSS1197和3’UTR报告质粒pMIR-IFNG-3’UTR。3.调控IFN-y表达的miRNA的筛选及验证将合成的miRNAmimics分别与IFN-y启动子报告质粒pGL3-TSS1197共转染HEK-293T细胞,利用双荧光素酶报告系统筛选到能抑制IFN-γ启动子活性的miR-27a。同时将合成的miRNAmimics分别与IFN-γ3’UTR报告质粒pMIR-IFNG-3’UTR共转染HEK-293T细胞,利用双荧光素酶报告系统筛选到miR-27a能够与IFN-γ3’UTR结合并具有负调控作用,并利用miRNAinhibitors对miR-27a的负调控作用进行了验证。进一步利用相应靶点突变报告质粒,确定了miR-27a结合IFN-γ启动子及3’UTR的靶点。4.miR-27a抑制T细胞中IFN-γ表达为了进一步在T细胞中探究miR-27a对IFN-γ表达的影响,将T-bet表达质粒和miR-27amimics电转EIA细胞,并用适量浓度的PMA和ionomycin刺激,24h后收集样品并利用Real-TimePCR和ELISA分别检测IFN-γmRNA和蛋白的表达水平。结果]miR-27a能显著下调EIA细胞中IFN-γmRNA和蛋白的表达,说明在T细胞中miR-27a对IFN-γ的表达具有负调控功能。5.IFN-γ表达与miR-27a表达之间的关系为了更深入的阐明miR-27a在调控IFN-γ表达中的作用,我们分析了IFN-γ的表达与miR-27a表达之间的关系。加入PMA和ionomycin诱导EL4细胞中IFN-y表达,并分别于刺激后6h、12h、18h、24h检测miR-27a的表达水平。结果显示,加入PMA和ionomycin刺激12h后,miR-27a的表达被显著抑制,但在随后的12h内逐渐恢复正常。说明在T细胞中,表达量快速增加的IFN-γ在早期能显著抑制miR-27a的表达,但随着时间的推移,抑制作用逐渐减弱。
【作者】高志嵩；
【导师】肖少波；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】microRNA；miR-27a；IFN-γ；启动子；3’UTR；

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