骆驼刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2~T全基因组测序及耐盐相关功能基因的研究

【摘要】根瘤菌与豆科植物骆驼刺所形成的共生体系在西北干旱半干旱荒漠地区具有很好的生存能力，该共生体系能很好的在盐碱地生存并表现极强的抗逆特性，在防风固沙，防止沙漠化蔓延中起到及其重要的作用。骆驼刺中慢生根瘤菌MesorhizobiumalhagiXJ12-2T分离自新疆的疏叶骆驼刺，是实验室具有自主知识产权的新种。对该菌株进行了抗逆性研究，结果发现该菌株具有非常强的抗逆特性，能够耐受5%的NaCl，并且能在pH512的范围内良好生长。为了揭示M.alhagiCCNWXJ12-2T的耐盐分子机制，本文通过转座子突变技术对该菌耐盐相关功能基因进行来了鉴定，结合全基因组测序对该菌的渗透调节网络进行了分析预测。通过pRL27对M.alhagiCCNWXJ12-2T进行插入诱变，建立了库容达15000多的转座子突变体库，对突变体库中的结合子进行多次盐敏感筛选，获得了4株盐敏感突变株。这4株盐敏感突变株都对NaCl呈现不同程度的高度敏感性状，并且表现出非常稳定的敏感特性。生长测定发现，在NaCl浓度为0.3mol/L的水平上，突变体Mam1、Mam2、Mam3呈现非常明显的盐敏感性状，生长量不到野生菌M.alhagiCCNWXJ12-2T生长量的1/2，而突变体Mam4则尤为明显，随着NaCl浓度的增加呈非常明显的生长减弱趋势；同时，这4株菌对KCl也表现出敏感性状，而对LiCl、Na2SO4及蔗糖的敏感性不是很明显，预示相关基因在耐盐方面具有独特功能。运用转座子挽救法对转座子侧翼序列进行了克隆，在获得4个突变体Mam1、Mam2、Mam3和Mam4中，Tn5分别插入到了不同的基因中，命名为xj952、xj3794、xj1521和xj274。与全基因组测序结果进行比对，确定了突变基因在全基因组的位置并绘制了突变基因及侧翼基因的物理图谱，同时运用多种方法对这4个突变基因的功能进行预测及分析。xj952基因所编码假定蛋白MAXJ12004699可能为一个多药物抗性EamA家族膜转运蛋白；xj3794基因编码的蛋白为5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶；xj1521基因编码的蛋白为假定外膜分泌蛋白MAXJ1200972；xj274基因所编码假定蛋白MAXJ1201324可能为酰基转移酶家族的膜蛋白。通过三亲杂交，利用功能互补质粒pBBR1-MCS5将全长的xj952、xj3794、xj1521和xj274这4个基因导入到相应的盐敏感突变株中进行了功能互补验证。对功能互补菌在0.4mol/LNaCl的生长情况进行测定，结果发现相较于突变体，各功能互补菌在0.4mol/LNaCl条件下的生长均得到不同程度的恢复，其中突变体Mam1、Mam3生长量恢复到原菌的一半，而突变体Mam2、Mam4的生长量恢复程度要小一些，恢复到原菌的1/3，表明这四个基因确实和盐耐受性相关，在根瘤菌渗透调节及保护耐受胁迫方面发挥着作用。采用IlluminaHiSeq2000platform测序平台对M.alhagiCCNWXJ12-2T进行全基因组测序，测序工作由华大基因完成。对测序所得序列进行了拼接并完成了精细图的绘制。对获得的基因参照蛋白库KEGG、COG、SwissProt、TrEMBL、NR进行功能注释，全面分析了M.alhagiCCNWXJ12-2T全基因组序列特征，以及潜在的渗透调节相关基因。全基因组预测得到377个与渗透调节有关的基因，包括大量的参与渗透调节的转运系统及相容性溶质合成及转运基因。根据已有研究结果对这些基因进行归类分析，绘制了该菌可能的渗透调节网络。通过我们的实验，在M.alhagiCCNWXJ12-2T中，首次鉴定了3个新的基因，命名为xj952、xj1521和xj274，分别编码假定蛋白MAXJ12004699、假定外膜分泌蛋白MAXJ1200972、假定MAXJ1201324与该菌的耐盐性相关，同时鉴定了一个已知编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶的基因xj3794，也与该菌的耐盐性有关。通过全长扩增、序列分析、功能预测、亚细胞定位及胞外多糖分析等方法从多方面系统的分析了突变基因的功能及与该菌耐盐性的关系。
【作者】周美丽；
【导师】韦革宏；
【作者基本信息】西北农林科技大学，微生物学，2014，博士
【关键词】骆驼刺中慢生根瘤菌；CCNWXJ12-2T；转座突变；耐盐；功能互补；渗透调节；

【参考文献】
[1]韩江丽.产品数据管理系统中ET-RBAC权限管理模型的研究与应用[D].吉林大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[2]刘玉婷.从“发言人”到“对话者”：我国政府新闻发言人制度发展中政府身份的转变[D].西北大学,新闻学,2014,硕士.
[3]王咏倩.京剧“样板戏”唱腔中的管弦乐配器综述[D].中国戏曲学院,电脑音乐制作,2013,硕士.
[4]孟祥麟.内蒙古乌拉特前旗苏色格公墓景观设计研究[D].内蒙古农业大学,园林植物与观赏园艺,2012,硕士.
[5]张盼佳.平煤十三矿矿井通风系统优化研究[D].内蒙古科技大学,矿业工程,2014,硕士.
[6]王松.等截面PC连续箱梁桥施工温度场及裂缝控制研究[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[7]楚斐月.民事执行检察监督制度研究[D].华中师范大学,法律,2014,硕士.
[8]潘映雪.农杆菌介导BDN1基因转化马铃薯抗旱性研究[D].东北农业大学,作物遗传育种,2013,硕士.
[9]单宁伟.超氧化物歧化酶（SODs）与切花月季‘Samantha’失水胁迫耐性间的关联[D].中国农业大学,园林植物与观赏园艺,2004,硕士.
[10]张金龙.BC集团物流公司员工培训体系设计研究[D].西安工业大学,物流工程,2014,硕士.
[11]王昕昕.西安地区博物馆现状调查与分析报告[D].吉林大学,考古学及博物馆学,2014,硕士.
[12]周雪飞.我国企业形象宣传片的创意模式与发展特征[D].东北师范大学,新闻学,2012,硕士.
[13]於治益.地震属性聚类分析技术在储层预测中的应用[D].中国石油大学（华东）,地质工程,2012,硕士.
[14]刘宝玉.石油物探新技术研讨会在宜昌市召开[J].石油地球物理勘探,1994,06:739.
[15]邢翠娟.不同浸润性聚苯胺微/纳米结构的合成及防腐蚀性能[D].中国海洋大学,海洋化学工程与技术,2014,博士.
[16]王奕婷.图像特征信息提取的算法研究[D].西安科技大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[17]魏陆垚.地震作用下上承式拱桥破坏机理与动力分析[D].重庆交通大学,结构工程,2012,硕士.
[18]叶献玲.论主题式CBI模式在中国英语教学中的应用[D].广西师范大学,教育,2003,硕士.
[19]蒋励.食蟹猴模型中sC-MSCs定向分化修复软骨缺损的实验研究[D].复旦大学,外科学,2012,博士.
[20]徐健乔.具有尺度变换不变性的非刚体三维模型检索研究[D].北京交通大学,2014.
[21]韩荣振.感知设备监控构件在智能交通中的应用研究[D].山东师范大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[22]杨潇潇.“组合汉语”视野下的汉语作为第二语言口语教学设计研究[D].安徽大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[23]陈祎淼.中国石墨烯第1号标准正式发布[N].中国工业报,2014-02-13A03.
[24]吴亚婷.天水市体育旅游资源开发研究[D].西安体育学院,体育人文社会学,2013,硕士.
[25]芦站根,周文杰,赵昌琼,陈京,谈锋.曼地亚红豆杉对自然降温的适应性研究[J].植物生态学报,2004,01:73-77.
[26]李丽坤.基于主动学习的bug自动分配[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[27]崔强,朱卫东.基于数据挖掘的铁路机务段成本控制系统[J].铁路计算机应用,2003,01:11-13.
[28]王淑花,黄俊,郑忠明,季磊.间接挤压铸造浇口形状对充型形态的影响[J].轻工机械,2015,01:11-13.
[29]方炜.一类特殊本原有向图的scrambling指数及广义competition指数[D].中北大学,组合数学,2013,硕士.
[30]侯晋.苏州城市轨道交通振动计算与测试分析[D].苏州大学,车辆工程,2014,硕士.
[31]王俊杰.碟式太阳能热发电吸热器的数值模拟研究[D].内蒙古工业大学,热能工程,2013,硕士.
[32]胡晓琳.西汉语言中性别歧视的比较研究[D].广东外语外贸大学,西班牙语语言文学,2013,硕士.
[33]张文倩.艺术家的神经性心理与艺术创作探析[D].东北师范大学,美术学,2012,硕士.
[34]杨哲.辽宁银珠集团产品结构优化研究[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[35]易永辉,曹一家,郭创新,刘波.基于XMLSchema技术的IEC61850通用网关设计[J].电力系统自动化,2007,02:60-64.
[36]周登珊.唐代直诉制度研究[D].天津商业大学,法学理论,2013,硕士.
[37]余明.USB 2.0设备控制器的设计及验证[D].北京交通大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[38]崔哲.军队训练管理系统的设计与实现[D].东北大学,计算机技术,2010,硕士.
[39]尚娜娜.区域劳动生产率的空间关联与分异研究[D].浙江工商大学,统计学,2013,硕士.
[40]张胜健,辛永磊,许立坤,杜爱玲.NaCl浓度对金属氧化物阳极电化学性能与失效影响研究[J].热加工工艺,2015,06:60-63+66.
[41]马东伟.29例胰腺内分泌肿瘤外科治疗临床分析[D].大连医科大学,外科学,2012,硕士.
[42]温志军.政府在推动建筑业施工人员培训中的作用[D].重庆大学,建筑与土木工程,2003,硕士.
[43]傅嘉.石墨烯万亿元产业规模有望提速[N].中国矿业报,2013-07-20A06.
[44]王真.基于典型物料透气阀袋包装技术研究[D].江南大学,包装工程,2012,硕士.
[45]胡俊飞,阮健,李胜,丰章俊.电液高频疲劳试验机的控制系统设计研究[J].浙江工业大学学报,2015,01:58-61.
[46]刘以刚.配电变压器绕组故障在线诊断方法研究[D].重庆大学,电气工程,2014,硕士.
[47]陆紫微.非负重状态下3.0T MR T2mapping及IDEAL成像在评价椎间盘退变中的应用[D].苏州大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[48]张慧.量子点的制备及其在生物检测中的应用研究[D].南昌大学,分析化学,2014,硕士.
[49]毓添婧.基于MEMS倾角仪的建筑结构地震过程转角监测[D].大连理工大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[50]齐向彤,陈秋双.具有约束条件的单机JIT调度问题[J].自动化学报,1998,03:135-137.