透骨草杀虫活性成分及其作用机理研究

【摘要】透骨草（PhrymaleptostachyaL.），为透骨草科透骨草属多年生草本植物，广泛分布于喜马拉雅山脉、北美洲和亚洲东部，在东亚一直被用作传统的杀虫植物。我国主要分布在东北、华北及长江流域各地。本论文以透骨草为研究对象，系统研究了其杀虫活性及活性成分，并对其主要杀虫活性成分双氧木脂素A的作用机理进行了初探。主要研究结果如下：1.系统评价了石油醚、乙酸乙酯和甲醇超声提取物的杀虫活性。结果表明，三种提取物对供试的粘虫（Mythimnaseparate）幼虫、家蝇（Muscadomestica）成虫及淡色库蚊（Culexpipienspallens）幼虫有明显的毒杀活性，对3龄粘虫幼虫8h的胃毒麻醉中浓NC50分别为1690μg/mL、6240μg/mL和11390μg/mL，8h的触杀麻醉中量ND50分别为2.26μg/头、7.20μg/头和24.35μg/头；对家蝇成虫24h的胃毒致死中浓LC50分别为1580μg/mL、2940μg/mL和4990μg/mL；对家蝇成虫24h触杀致死中量LD50分别为1.80μg/头、3.32μg/头和5.56μg/头；对4龄淡色库蚊幼虫24hLC50分别为3.23μg/mL、5.24μg/mL和61.86μg/mL。对小菜蛾（Plutellaxyllostella）幼虫和豆蚜（Aphiscraccivora）无翅成蚜没有明显的毒杀作用。2.以活性追踪为指导，采用多级硅胶柱层析、凝胶柱层析及RP-HPLC等方法，从透骨草甲醇提取物中分离出5个杀虫活性化合物。采用NMR、UV及HR-ESI/MS等技术对其中4个化合物进行了结构鉴定，4个化合物均是具有二氧双环辛烷骨架的双骈四氢呋喃型木脂素，分别为透骨草灵-I、透骨草灵B、双氧木脂素E及双氧木脂素A，其中透骨草灵B为首次报道的新化合物，双氧木脂素E首次从透骨草中分离得到。3.杀虫活性测定结果表明，（1）透骨草灵-I对3龄粘虫幼虫只具有麻醉活性，其8h麻醉中浓NC50为2580μg/mL，对4龄淡色库蚊幼虫有一定的毒杀活性，24h毒杀致死中浓LC50为1.21μg/mL。（2）透骨草灵B对3龄粘虫幼虫和4龄淡色库蚊幼虫均有一定的毒杀作用，对3龄粘虫幼虫24h胃毒致死中浓LC50为490μg/mL，对4龄淡色库蚊幼虫24h毒杀LC50为0.69μg/mL。（3）双氧木脂素E对多种供试试虫有一定的杀虫活性，对3龄粘虫幼虫24h胃毒LC50为53μg/mL，24h触杀LD50为0.26μg/头；对3龄槐尺蠖（Semiothisacinerearia）幼虫24h胃毒LC50为1680μg/mL，24h触杀LD50为1.33μg/头；对家蝇成虫24h胃毒LC50为970μg/mL，24h触杀LD50为1.12μg/头；对4龄淡色库蚊幼虫24h毒杀LC50为0.15μg/mL；对美洲大蠊（Periplanetaamericana）成虫48hLD50为7.28μg/头。（4）双氧木脂素A对多种供试试虫有很强的杀虫活性，对3龄粘虫幼虫24h胃毒LC50为35μg/mL，24h触杀LD50为0.09μg/头；对3龄槐尺蠖幼虫24h胃毒LC50为66μg/mL，24h触杀LD50为0.049μg/头；对家蝇成虫24h胃毒LC50为39μg/mL，24h触杀LD50为0.047μg/头；对4龄淡色库蚊幼虫24h毒杀LC50为0.025μg/mL；对美洲大蠊成虫48hLD50为4.98μg/头。4个化合物对小菜蛾幼虫和豆蚜无翅成蚜没有明显的毒杀作用。4.症状学观察表明，以LD90剂量双氧木脂素A点滴处理6龄粘虫幼虫和家蝇成虫后，粘虫幼虫麻醉、部分试虫不自主肌肉收缩、震颤，直至死亡；家蝇成虫很快兴奋，接着麻醉直至死亡；美洲大蠊成虫先是重心抬高、腹部屈曲，随后麻醉直至死亡。5.双氧木脂素A对粘虫头部ATP酶的测定结果表明，双氧木脂素A抑制了5龄粘虫头部Na+-K+-ATPase活性，激活了Ca2+-Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性。离体条件下双氧木脂素A对Na+-K+-ATPase最大的抑制率为32.77%，活体条件下最大的抑制率为59.72%；离体条件下对Ca2+-Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase最大激活率分别为33.48%、30.34%，活体条件下对Ca2+-Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase最大的激活率分别为29.72%、28.83%。离体条件下对三种ATP酶在某种程度上均具有一定的剂量效应。6.对果蝇幼虫神经-肌肉接点电位测定结果表明，双氧木脂素A使自发性接点电位（mEJP）释放频率增加，出现了波浪状发放，对兴奋性接点电位（EJPs）没有明显影响。7.测定了双氧木脂素A对美洲大蠊离体神经细胞胞浆中游离[Ca2+]i动力学的影响。结果表明，10nmol/L到100μmol/L浓度范围双氧木脂素A都可引起胞内游离[Ca2+]i升高，且胞内钙水平升高与双氧木脂素A的浓度正相关。双氧木脂素A作用部位是细胞质膜和内质网膜，其作用靶标是质膜上的L-型Ca2+通道和内质网膜上的RyR钙通道，引起外钙内流和内钙释放，使得胞内钙水平升高。双氧木脂素A与nifedipine竞争结合于L-型Ca2+通道，与咖啡因在RyR钙通道上存在不同的亲和位点。8.双氧木脂素A激活L-型Ca2+通道，促进外钙内流；L-型Ca2+通道与RyR在胞浆区的部分相互作用，其构象发生改变并通过蛋白质间的相互作用激活RyR，Ca2+释放通道开放，内质网上的Ca2+释放。外钙内流和内钙释放致使胞浆中游离[Ca2+]i升高，Na+离子流受到抑制，从而抑制Na+-K+-ATPase活性；而突触前膜内Ca2+水平升高，Ca2+结合在囊泡膜上，减少了膜表面的负电荷，使得囊泡之间以及囊泡与突触前膜的粘附易于发生，神经-肌肉自发性接点电位（mEJP）释放频率增加，引起兴奋性神经递质释放，并扩散通过突触间隙，与突触后膜上的受体相结合，引起后膜去极化，形成突触后电位。突触后电位达到Na+的活化阈值，就产生一个新的动作电位，引起中毒试虫的肌肉收缩、震颤直至死亡。
【作者】肖新敏；
【导师】吴文君；
【作者基本信息】西北农林科技大学，农药学，2014，博士
【关键词】透骨草；杀虫活性；透骨草灵B；双氧木脂素A；作用机理；

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