小麦雄性不育蛋白组学与泛素化修饰蛋白组学的研究

【摘要】杂种优势是生物界的一种普遍现象，利用杂种优势可以显著地提高作物的产量和品质。目前在水稻、玉米、高梁、油菜等作物被广泛应用并获得了前所未有的成功。大量研究和生产实践亦表明，小麦也具有明显的杂种优势，深入研究与开发利用是大幅度提高小麦产量和品质的一种重要途径。小麦杂种优势利用的基础是雄性不育，因此小麦雄性不育的创制和不育机理的研究成为杂种优势充分利用的前提。特别是化学杂交剂诱导不育途径，如新型杀雄剂SQ-1，具有杀雄彻底、不影响雌蕊正常结实等诸多优点，理论上可以利用任何亲本来组配强优势组合。但是，化学杂交剂SQ-1诱导小麦雄性不育的机理仍不清楚。随着蛋白质组学的发展，雄性不育的研究逐渐在蛋白质组学上呈现增多趋势。利用蛋白质组学分析研究正常发育与生理型不育小麦的花药在发育过程中的蛋白表达差异，可以较全面的掌握与育性相关的蛋白及修饰类蛋白。有鉴于此，本研究选用西农1376小麦为试材，应用双向凝胶电泳技术、westernblot技术、荧光定量技术，对喷施化学杂交剂SQ-1导致不育与喷施清水作为对照的正常可育小麦，在不同时期的花药或小花蛋白的差异表达谱进行分析，旨在从蛋白质组学水平和泛素化修饰蛋白组学水平上探寻在化学杂交剂诱导小麦雄性不育过程中的蛋白以及泛素化修饰蛋白的变化特征，为今后进一步探索生理型小麦雄性不育的机理及相关蛋白或基因的研究奠定基础。获得的主要结果如下：1，以双向电泳技术为依托，对花药四分体，单核期和三核期的全蛋白进行分析，在两倍差异、95%显著性的设定条件下，通过PDQuest分析共得到128个差异蛋白点，通过质谱鉴定分析，有103个蛋白通过小麦库和绿色植物库被成功鉴定。共同上调表达或下调表达的蛋白点有16个，其中有15个得到成功鉴定，这些蛋白大部分是碳水化合物代谢和细胞壁相关蛋白以及活性氧代谢蛋白。雄性不育的花药与氧化还原相关蛋白呈上调表达的有谷胱甘肽硫基转移酶、假定的In2.1蛋白、超氧化物歧化酶和过氧化物酶，这些酶都可以清除植物体内的活性氧。同时，活性氧水平在不育花药中显著高于可育花药，这也表明活性氧胁迫与小孢子的败育存在一定的关系。另外，β-1,3-葡聚糖酶和液泡转化酶研究认为和雄性不育的发生直接相关。光合作用相关蛋白、26-S蛋白酶体蛋白、ABC转运蛋白、组蛋白、转录抑制因子以及信号转导等也在本试验中得到鉴定。结合表型分析和石蜡切片分析，从双向电泳得到的差异蛋白表明化学杂交剂诱导的雄性不育是一个非常复杂的网络调控过程，本研究为化学杂交剂SQ-1诱导小麦雄性不育的机理在蛋白水平提供了重要的线索。2，蛋白质的多聚泛素化可以调节多种生物功能，包括育性的调控。化学杂交剂SQ-1诱导的小麦雄性不育过程的发生主要是花粉的败育，花粉败育的主要原因是杂交剂喷施抑制到花粉发育进程，诱导花粉内含物降解，形成畸形花粉，这一过程在全蛋白差异蛋白组学中得到验证即涉及到UPP途径介导的蛋白质降解过程。采用泛素蛋白富集试剂盒富集泛素化底物蛋白，通过LC-MS/MS进行质谱鉴定，鉴定出的假定多聚泛素蛋白包括热激蛋白70、ATP合酶亚基、UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)，糖基转移酶，类似Pm3b抗病蛋白，锌指转录因子，甘油醛3-磷酸脱氢酶，植物碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白转录因子，泛素相关的酶类、细胞色素P450、20S蛋白酶体亚基等一系列假定多聚泛素化蛋白质。结果表明多聚泛素化蛋白影响到了雄性不育过程，鉴定到的泛素化蛋白涉及到了糖酵解过程，转录过程，能量代谢过程，以及小孢子发育过程中极为关键的一些特异性蛋白的代谢，现有的研究发现小麦雄性不育进程中泛素化蛋白起到了非常关键的作用。3，以小麦正常可育系和遗传型雄性不育系作为对照，研究化学杂交剂诱导的生理型雄性不育系β-1，3-葡聚糖酶活性在各个时期相对表达量分析表明，在小孢子母细胞减数分裂期正常可育花药的β-1，3-葡聚糖酶活性显著高于生理型雄性不育系及遗传型雄性不育系，而两个不育系之间差异不大。到四分体时期，三种类型的小麦相比，正常可育花药维持了在减数分裂时期的相对高活性状态，生理型雄性不育系及遗传型雄性不育系之间无明显差别，但是与减数分裂期相比，β-1，3-葡聚糖酶活性均呈现明显下降的趋势。单核期与四分体相比，β-1,3-葡聚糖酶活性均呈现极显著增高的趋势，但此时正常可育花药与不育之间仍然差异明显。这说明在不育过程中可能从减数分裂期开始胼胝质的累积过程以及β-1,3-葡聚糖酶活性等出现了异常变化。实时荧光定量PCR技术对UGPase基因在小麦正常可育系、化杀诱导的生理型不育系和遗传型不育系花药发育的各个时期的基因相对表达量分析表明在减数分裂至四分体时期，正常可育花药中UGPase基因高度表达，且与化杀不育和遗传不育之间的差异极显著表明，在这个发育期间不育花药的胼胝质累积过程可能出现了异常。另外，花药败育的关键时期可能在减数分裂期至四分体时期与胼胝质的沉积和降解有一定的相关性，这与我们以前所认为的败育的关键期开始于单核期有差别。4，采用SDS-PAGE和westernblot相结合的方法对植物线粒体蛋白的泛素化做了初步探究。正常植株的小花在发育过程中80kD这一蛋白的泛素化水平变化不是很明显，在二核期泛素化水平高于单核和三核，而化杀小花在发育过程中泛素化水平随着发育时期呈现明显下降的趋势，到花药发育至三核期时小花的这一蛋白泛素化水平下降到极限。在单核期化学杂交剂诱导的小麦不育小花其这一条带的泛素化水平明显高于正常。花药发育至三核期的小花中，不育小花的泛素化水平几乎检测不到，而此时正常的小花中的泛素化水平仍然呈现较高的水平，这表明在小麦喷施化学杂交剂以后，小花线粒体蛋白发生泛素化的过程可能出现了异常，这也很可能影响到了线粒体的正常代谢过程，导致呼吸作用紊乱，ATP的产生受阻，导致花药能量供应不足，从而淀粉积累受阻以致引起了最终的败育。5，13%SDS-PAGE凝胶电泳对不同处理材料不同时期的组蛋白进行电泳分离，westernblot发现组蛋白的H3、H2A和H2B均发生了泛素化，但组蛋白H2B的泛素化程度最高。正常小花和不育小花H2B的泛素化水平相比，单核期表现泛素化有极显著差异。组蛋白H3的泛素化水平较H2B低很多，但在单核期也表现出正常小花的H3泛素化水平高于化杀不育的小花，在随后的二核期和三核期正常与不育小花之间的H3泛素化几乎没有差异。催化H2B泛素化的泛素连接酶RAD6基因在花药发育至单核期、二核期和三核期相对应的小花的表达量变化趋势与H2B的泛素化程度在三个时期的变化趋势基本一致，表明在花药的单核期，由于化学杂交剂的诱导作用，不育株小花的RAD6基因的表达明显受到抑制。在目前的研究中表明组蛋白的泛素化在单核期差异明显，而且催化组蛋白H2B的连接酶RAD6的表达水平与组蛋白H2B的泛素化水平相一致，这也说明在小麦雄性不育的过程中，组蛋白的泛素化可能起到了一定的作用。
【作者】刘红占；
【导师】张改生；
【作者基本信息】西北农林科技大学，作物遗传育种，2014，博士
【关键词】小麦；雄性不育；质谱分析；泛素化；胼胝质；

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