结核分枝杆菌oplA基因功能研究&结核分枝杆菌HBHA蛋白在妇科结核病血清学诊断中的价值研究

【摘要】结核病是世界范围内传染病中的“头号杀手”。研究结核病的发病机制对结核病防控工作尤为重要。经预测，结核分枝杆菌基因组中的Rv0266c编码了一个5-oxo-prolinase，被命名为OplA，可催化5-oxo-proline生成L-glutamate，并水解一分子ATP生成ADP和Pi。这一反应在真核生物中普遍存在，且为GSH循环中的关键组成。而该酶的功能在原核生物中鲜有研究，本文拟从结核分枝杆OplA基因Rv0266c入手，探究其基因功能，为结核病发病机制的研究提供思路。研究内容：拟通过分子克隆技术和异源表达技术，克隆和表达oplA基因，通过亲和层析和包涵体纯化复性对目的表达产物进行分离纯化，SDS-PAFE检测其纯化效果，以期获得可溶性OplA蛋白，进一步进行体外酶学活性测定。通过同源重组双交换基因敲除技术，敲除OplA，验证其体内功能，通过建立生长曲线，比较野生型、敲除株、回补株的差异，探究其对菌体生长的影响。通过建立细胞感染模型，探究其对细菌毒力的影响。结果：通过尝试优化表达体系的各种参数、未获得纯化的可溶性OplA。通过基因敲除技术成功敲除了OplA在基因组中的整个ORF。建立了生长曲线，发现培养后期，敲除株生长情况优于野生型。通过细胞感染模型的建立，发现敲除株和野生型对细菌毒力影响的差异较小。结论：OplA的复杂结构和大分子量可能是影响其分离纯化的重要因素。有氧条件下，结核分枝杆菌的生长不依赖于OplA。通过感染模型实验证明OplA对结核分枝杆菌的毒力影响不十分显著，有待进一步研究验证。研究背景：中国是一个结核病高负担国家，当前由于妇科结核引发的公共健康问题不容忽视，妇科结核是导致不育症发生的一个重要因素。当前妇科结核的诊断局限较多。血清学诊断相对其他诊断方法，操作简便，风险低，易推广，以往的研究证明HBHA与肺外结核的发生密切相关。研究目的：探索及研究结核分枝杆菌HBHA在妇科结核病血清学诊断中的应用价值。研究方法：首先对重组异源表达的HBHA抗原蛋白利用亲和层析技术进行分离纯化，通过免疫小鼠获得小鼠的抗血清，再经SDS-PAGE、Westernblot免疫印迹鉴定纯化产物及其抗原性。收集筛选临床样本，进行分组。通过ELISA方法对所收集的临床样本进行检测，利用SPSS21.0软件及GraphPadPrism5.0软件进行作图和统计学分析。研究结果：通过异源表达、亲和层析、SDS-PAGE分析得到了纯度较高的重组HBHA蛋白，通过免疫小鼠，验证了重组HBHA蛋白有着较好的抗原性。通过临床采集和严格筛选，一共纳入了178例血清样本，其中纳入了36例临床确诊的妇科结核病人血清样本，健康对照组中，47例PPD阴性血清样本，47例PPD阳性血清样本，48例患有普通妇科疾病（OGD）但排除结核病的血清样本。通过ELISA检测，对所得数据进行统计分析，建立了ROC曲线，IgG检测方法诊断FGTB的诊断临界值为0.627ng/mL，其特异度为93.62%(95%CI,82.46%:98.66%)，敏感度为72.22%（95%CI，54.81%:85.80%），曲线下面积为0.86（95%CI，0.78:0.94），阳性预测值为89.66%（95%CI，73.62%:96.42%），阴性预测值为81.48%（95%CI，69.16%：89.62%），假阴性率（漏诊率）为27.78%，假阳性率（误诊率）为6.38%。IgM检测方法诊断FGTB的诊断临界值为0.585ng/mL，其特异度为93.62%(95%CI，82.46%:98.66%)，敏感度为47.22%（95%CI，54.81%:85.80%）。曲线下面积为0.74（95%CI，0.63:0.85），阳性预测值为78.79%（95%CI，62.25%:89.32%），阴性预测值为80.39%（95%CI，67.54%:88.98%），假阴性率（漏诊率）为8.51%，假阳性率（误诊率）为52.78%。结论：通过比较及综合分析两种血清学诊断FGTB的方法，发现通过ELISA检测血清中抗HBHA特异抗体IgG优于IgM，且检测的特异度和敏感度均较高。
【作者】王伟；
【导师】李传友；
【作者基本信息】北京市结核病胸部肿瘤研究所，免疫学，2014，博士
【关键词】结核分枝杆菌；OplA；基因功能；结核分枝杆菌黏附菌素；妇科结核；酶联免疫吸附试验；诊断；

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