EDCs暴露对稀有鮈鲫脑中生殖调控相关基因表达及转录组的影响

【摘要】环境中的内分泌干扰物（EDCs）能模拟体内激素，破坏人类和其他动物的正常内分泌功能。EDCs能影响神经内分泌系统的生殖调控，这种调控机制涉及下丘脑-垂体-性腺（HPG）这条生殖轴线的各个层面。HPG轴主要是由促性腺激素释放激素、促性腺激素和性类固醇激素三种激素调节的。稀有鮈鲫被广泛用于水生毒理学的研究，是研究EDCs的一种理想模式鱼类。本研究首先克隆并使用三种计算方法筛选了研究稀有鮈鲫mRNA表达所需的内参基因；其次采用实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测了经BPA/EE2暴露之后，稀有鮈鲫HPG轴上与编码和调控上述激素相关的12个基因在脑中和性腺中的表达情况。除此之外，还采用了高通量测序技术分析了EE2暴露之后稀有鮈鲫脑组织基因转录组特征。本研究主要包括以下结果：（1）在稀有鮈鲫中克隆得到了5个常用的看家基因：转录延长因子（ef1a）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapdh）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（g6pd）、TATA-box结合蛋白基因（tbp）和α微管蛋白基因（tuba1）。利用qRT-PCR的方法检测了稀有鮈鲫早期发育阶段全鱼组织（18-50dpf）、经EDCs暴露之后的幼鱼全鱼组织和成鱼性腺组织的β肌动蛋白基因（actb）和上述五个看家基因的mRNA表达稳定情况。根据geNorm、NormFinder及BestKeeper三种计算方法对基因稳定性进行排序，从而筛选出最适合的内参基因。同样的，经EDCs暴露之后，对4个看家基因（actb、ef1a、gapdh和tuba1）在成鱼脑中表达的稳定性进行排序。结果显示actb基因在幼鱼发育阶段及EDCs暴露之后的幼鱼全鱼及成鱼性腺中表达最稳定；EDCs暴露之后成鱼脑中ef1a基因表达最稳定。EDCs影响了幼鱼g6pd和tuba1mRNA的表达，而未影响actb、ef1a、gapdh和tbpmRNA的表达。（2）克隆了编码稀有鮈鲫促性腺激素释放激素两个亚型（GnRH2、GnRH3）、促性腺激素释放激素受体1的两个亚型（GnRHR1A、GnRHR1B）、促性腺激素的两个β亚基（FSHβ、LHβ）和促性腺激素受体（FSHR、LHR）共8个基因的全长序列。通过系统发育树和氨基酸多重比对发现，稀有鮈鲫与其他鲤科鱼类的上述8个基因具有较高同源性。采用qRT-PCR的方法检测了GnRH2、GnRH3、GnRHR1A、GnRHR1B、FSHβ、LHβ、FSHR和LHR的组织表达情况，结果显示GnRH2、GnRH3、GnRHR1A、GnRHR1B、FSHβ和LHβ主要在脑中表达，而FSHR和LHR主要在性腺中表达。（3）qRT-PCR方法检测了8月龄稀有鮈鲫经过5和15μg/LBPA处理35天后脑中GnRH2、GnRH3、GnRHR1A、GnRHR1B、FSHβ和LHβ及性腺中P450芳香化酶（cyp19a1a）、FSHR和LHR表达量情况。同时观察了暴露之后卵巢的组织学变化，发现15μg/L的BPA抑制了卵母细胞成熟。15μg/LBPA能显著抑制卵巢和精巢中cyp19a1a的表达，此浓度的BPA会上调雌性稀有鮈鲫脑中GnRH3和GnRHR1A的表达。（4）3月龄稀有鮈鲫经过1、5、25和125ng/LEE2暴露3天和6天后，对脑组织中的FSHβ、LHβ和雌激素受体（esr1、esr2a和esr2b），性腺组织中的FSHR、LHR和cyp19a1a基因的表达量进行了检测。LHβ表达被显著抑制，而FSHβ的表达则没有受到影响。EE2经6天暴露后均能显著抑制esr2b的表达；1和25ng/L的EE2暴露6天能显著促进雌鱼esr2a的表达；esr1的表达未受EE2影响。皮尔逊相关性分析显示雄鱼脑中esr2a的表达与LHβ的表达负相关，雌鱼脑中esr2a的表达与LHβ的表达正相关，esr2b的表达与LHβ的表达负相关。在雄鱼中，EE2能够显著抑制精巢中FSHR的表达；而在雌鱼中，EE2能够显著促进卵巢LHR的表达。EE2均能显著抑制雌雄鱼性腺中cyp19a1a的表达。在精巢组织中FSHR和LHR的表达都与cyp19a1a正相关。（5）采用高通量测序技术研究了25ng/LEE2暴露7天之后稀有鮈鲫脑组织的转录组特征。构建了雌雄鱼脑中对照组及处理组共8个数字基因表达谱文库。每个文库均获得超过0.68Gb的reads。与对照组比较，雌鱼脑中有276个差异表达的基因，包括132个上调表达基因和144个下调表达基因；雄鱼脑中有194个差异表达的基因，包括110个上调表达基因和84个下调表达基因。GO功能富集分析表明雌鱼的差异表达基因主要参与生物过程，尤其在代谢过程中差异富集最显著；雄鱼的差异表达基因没有显著性富集。KEGG通路显著性富集分析发现EE2暴露之后，雌雄鱼脑中差异表达基因分别富集到92个和85个KEGG通路中。雌鱼脑中的差异表达基因主要富集于氧化磷酸化通路、核糖体信号通路和总代谢通路。综上所述，本文研究了BPA和EE2对雌雄稀有鮈鲫HPG轴的内分泌干扰作用。基于上述研究，它不仅能帮助我们了解EDCs可能的雌激素作用机制，也能为研究EDCs对其它脊椎动物乃至人类的危害及作用机理提供可靠的理论依据和基础。
【作者】秦芳；
【导师】王在照；
【作者基本信息】西北农林科技大学，水生生物学，2014，博士
【关键词】下丘脑-垂体-性腺轴；稀有鮈鲫；内分泌干扰物；实时定量PCR；数字基因表达谱；

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