Fyn在小鼠肝脏葡萄糖代谢中的作用及机理研究

【摘要】胰岛素抵抗引起的肝脏葡萄糖输出异常增加是造成型糖尿病高血糖症的主要诱因。因此，揭示调控肝脏葡萄糖代谢的分子机理或能为型糖尿病的治疗提供新的靶点。体内葡萄糖稳态的调控是多个组织间对代谢和营养状况的动态复杂综合反应。葡萄糖代谢主要受胰高血糖素和胰岛素的调控。摄食后，外周组织（骨骼肌和脂肪组织）的胰岛素水平升高，促进肝脏糖原合成，同时抑制肝脏糖异生作用。禁食状态，胰高血糖素刺激肝脏葡萄糖释放进入血液，经血液循环保证外周组织的稳定葡萄糖供应。因此，血糖水平受饮食和营养状况紧密调控。饥饿时，葡萄糖来源于两个途径：糖原分解和糖异生作用。糖原在小鼠禁食后数小时内完全分解，因此糖异生作用在长时间禁食的情况下具有非常重要的作用。为了保证产生的葡萄糖能够满足整个机体的需求，糖异生途径必须受到精确调控。Fyn属于非受体酪氨酸激酶Src家族成员，研究证明该家族受多种细胞外信号调控，参与调控多个细胞和组织功能，如细胞迁移、增殖和分化、细胞周期、免疫应答和肿瘤发生等。虽然Fyn酪氨酸激酶的全身敲除小鼠（FynKO）已存在多年，但是对其研究主要集中在上述领域，其代谢特征尚未见研究报道。近来本实验室研究发现，FynKO小鼠外周组织对胰岛素的敏感性增加，导致FynKO小鼠的葡萄糖清除率提高。同时，禁食后FynKO小鼠的血糖和胰岛素水平分别降低了约30%和60%，表明肝脏的葡萄糖耐受性提高与胰脏细胞作用无关。但是fyn调控肝糖代谢的具体分子机理（通路）尚待进一步研究揭示。本研究以FynKO小鼠为实验动物模型，利用GlucoseMetabolismRT2ProfilerPCRArray技术筛选禁食条件下FynKO小鼠肝脏葡萄糖代谢过程中的差异表达基因，并对其结果进行real-timePCR或WesternBlot验证；试剂盒检测禁食FynKO小鼠肝脏的葡萄糖和糖原含量；腹腔注射葡萄糖、乳酸/丙酮酸（9:1）或甘油进行耐受性实验，并采用稳定同位素标记的[U-13C6]-葡萄糖和[U-13C]-甘油示踪肝脏的葡萄糖生成；液相色谱质谱分析代谢产物。此外，分离培养小鼠原代肝脏细胞和FAO细胞，分别转染fyn激酶活性缺失和持续活化载体，检测其对细胞葡萄糖生成的影响，同时利用Real-timePCR或WesternBlot检测糖异生途径相关基因的表达。从活体水平和细胞水平，探讨FynKO小鼠肝糖水平降低的具体生物学机理以及fyn对肝脏葡萄糖代谢的调控作用。获得的实验结果如下：1.RT2ProfilerPCRarray结果表明：糖异生途径基因果糖1,6-二磷酸酶（Fbp1）、葡萄糖6-磷酸酶（G6pc/G6Pase）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pck1/PEPCK）和丙酮酸脱氢酶激酶4（Pdk4）的mRNA表达水平较野生型（WT）显著下调，而糖酵解基因葡萄糖激酶（Gck）的表达水平上调；另外，糖原分支酶Gbe1的mRNA表达量降低，而糖原降解基因葡聚糖转移酶（Agl）和糖原磷酸化酶（Pygl）的mRNA表达水平上调。2.FynKO小鼠肝脏PEPCK的mRNA和蛋白表达量均降低约5倍，丙酮酸以及丙酮酸/乳酸混合物诱导的肝脏葡萄糖合成显著降低。3.上述结果在体外分离培养的原代肝脏细胞和FAO细胞中得到进一步证实。在cAMP/地塞米松存在的情况下，乳酸/丙酮酸或甘油诱导的FynKO原代肝脏细胞的葡萄糖合成显著降低，同时，促进肝脏甘油摄取的水-甘油通道蛋白AQP9的mRNA表达量显著下调。另外，在WT原代肝脏细胞中超表达Fyn激酶活性缺失载体，糖异生途径关键限速酶PEPCK和G6Pase表达量降低。与该结果一致，在FAO细胞中超表达Fyn激酶的持续活化表达载体后，糖异生基因PEPCK和G6Pase的表达量升高，FAO细胞的葡萄糖含量增加。4.甘油诱导的FynKO小鼠肝脏葡萄糖合成显著降低。通过甘油耐受性实验和13C-glycerol示踪、液相色谱质谱分析实验两方面证明了该结果。α-磷酸甘油的水平降低，但甘油激酶的蛋白表达水平无显著变化。5.FynKO小鼠果糖诱导的葡萄糖合成降低，而肝脏中果糖激酶的表达并未发生明显变化。磷酸二羟丙酮（DHAP）和3-磷酸甘油醛（G3-P）的含量与野生型相比变化不显著，说明丙糖激酶功能正常。肝脏醛缩酶（AldolaseB）的mRNA和蛋白水平不变，但果糖-6-磷酸含量降低了30倍，果糖-1,6-二磷酸水平降低了7倍，同时葡萄糖-6-磷酸也下降约2倍。这些结果表明aldolase活性的异构调控可能受损。6.FynKO小鼠肝脏中磷酸烯醇式丙酮酸的水平降低。除了PEPCK的活性降低外，PDK2和PDK4基因的mRNA水平降低，导致三羧酸（TCA）循环活性增加。乳酸含量降低，TCA循环中间代谢物柠檬酸、异柠檬酸盐和-酮戊二酸的含量增加。代谢产物谱分析结果表明高能电子由细胞质向线粒体的穿梭途径受损。草酰乙酸含量不变、苹果酸水平降低，-酮戊二酸和天冬氨酸水平升高表明苹果酸和-酮戊二酸的反向转运体受损。7.丙酮酸水平正常但是丙氨酸和-磷酸甘油含量降低，说明由于TCA循环活性增加，这些底物转化为丙酮酸，并在丙酮酸脱氢酶的催化下发生氧化酵解，而不是在丙酮酸羧化酶（PC）和PEPCK的催化下进行糖异生。因此，肝脏葡萄糖输出（HGP）降低。综上所述，本研究证明，不同糖异生底物诱导的FynKO小鼠肝脏葡萄糖合成显著降低，同时，PEPCK表达量显著下调。另外，由于丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物的解阻遏作用，TCA循环活性增加，糖异生底物在丙酮酸脱氢酶激酶的催化下通过转化为丙酮酸，进入TCA循环发生氧化酵解。进一步的研究工作应着重阐明FynKO小鼠肝脏aldolaseB的异构调控，明确fyn如何调控aldolase活性，探讨糖异生途径和TCA循环中的其他关键酶的调控作用。
【作者】杨映娟；
【导师】杨公社；JefferyEPessin；ClaireBastie；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物学，2014，博士
【关键词】Fyn激酶；肝脏葡萄糖生成；糖异生；aldolase；TCA循环；代谢产物；

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