子宫内膜缺血在腹腔子宫内膜异位病灶形成中作用及分子机制研究

【摘要】第一部分正常非缺血内膜建立小鼠子宫内膜异位症模型目的改良“同种异体腹腔注射正常非缺血子宫内膜”建立小鼠子宫内膜异位症（Endometriosis,EM）模型，研究影响建模的因素，探讨内膜数量及注射频次对内膜腹腔种植的影响。方法以8-10周龄的雌性C57BL/6近交系小鼠为模型鼠，对―同种异体腹腔注射内膜法‖进行如下改良：取供体鼠正常子宫内膜均匀切成1×1mm大小，将组织块装入20号针头后进行腹腔注射。研究内容：（1）内膜数量对内膜腹腔种植影响：根据腹腔注射内膜数量，建模鼠随机分为6组（n=10）：1片组,2片组,4片组,8片组,16片组,32片组。（2）根据内膜注射次数对内膜种植影响：以1片内膜作为单次注射量，注射间期为5天，根据注射次数分为5组（n=10）：1次组，2次组，3次组，4次组,5次组。建模后第7天观察病灶，取病灶作HE染色组织学检查。根据肉眼见典型病灶结合组织学检查内膜腺体为存活病灶。以成模率及内膜存活率作为评价内膜存活情况指标。成模率=建模成功鼠（只）/各组总建模鼠；内膜存活率=存活内膜总数（片）/腹腔注射内膜总数（片）。结果改良后“腹腔注射内膜法”建立EM模型具有以下优点：改良后内膜残留减少，异位病灶大小均匀，病灶分散，便于观察，成模率、内膜存活率稳定。（1）内膜数量对内膜腹腔种植影响：成模率随着注射内膜量增加而逐渐增加，从1片组20%（2/10）增加到8片组60%（6/10），当内膜数量到达16片以上时成模率达到100%（10/10）;Pearson相关分析内膜数量与成模率成正相关（R=0.982），呈二次函数曲线：Y=1.095+0.863x-0.18×2（R2=0.944，F=33.45，p=0.003）；内膜种植数量与内膜存活率相关（R=0.947），曲线拟合成二次函数曲线：Y=-1.167+3.72x-0.61×2（R2=0.972，F=69.127，p=0.001）。卡方检验8片组内膜存活率显著高于其它各组（p<0.05）。（2）内膜注射次数对内膜腹腔种植的影响：随着内膜注射次数增加，成模率逐渐增加，由1次组20%（2/10）增至5次组100%（10/10），Pearson相关分析内膜注射次数与成模率正相关（R=0.981），回归分析成二次函数曲线：Y=1.095+0.863x-0.18×2（R2=0.944，F=33.45，p=0.003）；内膜存活率与注射次数正相关（R=0.981），曲线拟合成幂函数曲线：Y=1.99X0.949（R2=0.962，F=88.357，p=0.011）。结论改良后“同种异体腹腔注射非缺血内膜”建立EM模型，病灶分散、病灶大小、数量、成模率、内膜存活率变异小，模型稳定，重复性好。内膜数量及内膜注射频次是影响建模的重要因素。大量内膜（大于16片）单次注射以及少量正常内膜（1片）多次注射成模率高达100%，表明正常非缺血内膜易于在腹膜种植存活。8片单次腹腔注射成模率“60%”，内膜存活率“40%”，病灶数3-5个，适于进行各种干预试验，是理想的EM建模方案。第二部分缺血内膜腹腔种植探讨目的月经期螺旋动脉强烈收缩导致子宫内膜严重缺血达4-48h，少许缺血内膜随经血逆流入盆腹腔，逆流内膜的转归决定了是否发生内异症。但由于伦理学原因，逆流内膜进入腹腔后的动态变化过程及转归目前仍不清楚。本研究以雌性C57BL/6小鼠为试验载体，观察不同程度缺血子宫内膜进入腹腔后的动态变化及最终转归。方法结扎供体鼠子宫弓形血管宫体端及卵巢端的方法阻断子宫血流，组织微氧测定仪精确测定子宫组织氧浓度已保证血管结扎可靠性。根据缺血时间（Hour）供体鼠随机分为6组：0h组、0.5h组、1h组、2h组、4h组、8h组。根据“改良腹腔注射内膜法”，采用8片单次注射方案进行建模。对应于供体鼠，180只建模鼠分为6组（n=30）：0h组、0.5h组、1h组、2h组、4h组、8h组。建模后24h每组处死10只，观察内膜早期变化，留取标本。建模后第7天处死剩余小鼠，观察、测量异位病灶，计算各组成模率及内膜存活率。留取建模前供体鼠内膜、建模后24h内膜及异位病灶行HE染色组织学观察，TUNEL染色测定细胞凋亡。结果建模前内膜细胞凋亡指数（AI）与缺血时间正相关（R=0.865，p=0.0029;建模后缺血时间与AI呈正相关（R=0.904，p=0.0048）;建模后24h各组AI均较建模前升高（p<0.05）。Spearman相关分析成模率与缺血时间呈负相关（R=-0.757，p=0.041）；内膜存活率与缺血时间呈负相关（R=-0.986，p=0.004）。结论内膜损伤程度与缺血时间正相关，严重缺血导致细胞坏死或凋亡。缺血内膜进入腹腔后24h，内膜损伤进一步加重，细胞凋亡明显增加。缺血降低内膜在腹腔种植存活，严重缺血（>4h）内膜进入腹腔后，细胞因坏死或凋亡而清除，不能在腹膜种植形成异位病灶。第三部分缺血预处理（IPC）在缺血内膜腹腔种植中作用及机制目的组织器官经过非致死性缺血后，能够增强其对随后严重缺血耐受性即缺血预处理(ischemicpreconditioning，IPC)。前期研究证实当内膜缺血大于4h时，内膜细胞进入腹腔后因凋亡而清除，不能在腹腔种植存活，这验证了正常妇女月经期逆流内膜的清除机制，但EM妇女逆流内膜能抵抗缺血诱导的细胞凋亡，在腹膜种植存活。推测：内异症妇女子宫异常收缩导致子宫内膜轻度缺血，产生IPC作用，保护内膜缺血性损伤，减少细胞凋亡，促进内膜腹腔种植。本研究以C57BL/6小鼠为试验载体建立小鼠子宫IPC模型，探讨IPC在缺血内膜腹腔种植中作用，IPC对内膜细胞凋亡调节作用以及IPC是否通过Akt信号通路调节细胞凋亡。方法共分三部分内容：（1）小鼠子宫IPC模型建立：卡前列素氨丁三醇（欣母沛）可诱导子宫收缩，导致子宫不同程度缺血。采用肌肉注射欣母沛imqd×3d的方法建立小鼠子宫IPC模型。根据欣母沛剂量，供体鼠分为5组：A组为0.125mg/kg体重，B组为0.25mg/kg体重，C组为0.5mg/kg体重，D组为1.0mg/kg体重。对照组E组肌注0.1ml注射用水。组织微氧仪动态测定子宫组织氧浓度变化，测定各组子宫最低氧浓度，缺氧（氧浓度<100μmol/l）持续时间。建模鼠对应分为A、B、C、D、E共5组，每组20只。建模后第7天观察病灶情况，计算各组成模率及内膜存活率。（2）IPC在缺血内膜腹腔种植中作用：根据上述试验，供体鼠以欣母沛0.5mg/kg体重，im,qd×3d作为IPC方案。第4天结扎子宫血管建立子宫内膜缺血模型（Ischemia,ISCH）。供体鼠根据IPC及缺血时间分为6组（n=30只）：IPC组，ISCH2h（缺血2h），ISCH4h组（缺血4h），IPC+ISCH2h组，IPC+ISCH4h组，CON组（对照组）。采用改良腹腔内膜注射法建立EM模型。受体鼠对应分为IPC组，ISCH2h组，ISCH4h组，IPC+ISCH2h组，IPC+ISCH4h组，CON组。取建模前及建模后24h内膜，行组织切片TUNEL染色检测细胞凋亡变化。建模后第7天观察病灶，计算各组建模率及内膜存活率。（3）IPC保护作用的分子机制本部分选择欣母沛0.5mg/kg体重，im,qd×3d作为IPC方案，结扎子宫血管2h作为子宫内膜ISCH模型。Akt特异性阻断剂LY294002（LY）进行阻断试验，于注射欣母沛前15min，静脉注射LY294002，剂量为10μmol/kg。根据IPC、ISCH及LY，32只鼠随机分为4组（n=8只）：CON组、ISCH组、IPC+ISCH组、LY+IPC+ISCH组。子宫缺血2h取内膜组织行TUNEL染色测细胞凋亡指数，WEST检测磷酸化Akt(p-Akt)及其下游底物磷酸化水平（p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6），以及活化caspase-3。结果（1）小鼠子宫IPC模型建立：Pearson相关分析发现最低氧浓度与欣母沛剂量呈负相关(p=0.049，R=-0.88)，缺氧持续时间与欣母沛剂量完全相关(p=0.000，R=1.0)。卡方检验C组成模率及内膜存活率高于A、B、D组及对照组（P<0.05）。（2）IPC在缺血内膜腹腔种植中作用：结果显示IPC+ISCH2h组成模率及内膜存活率高于ISCH2h组（p=0.028，p=0.000）；IPC+ISCH4h组成模率及内膜存活率高于ISCH4h组（p=0.035，p=0.024）。IPC+ISCH2h组AI低于ISCH2h组（p<0.05），IPC+ISCH4h组AI低于ISCH4h组（p<0.05）。（3）IPC保护作用的分子机制结果显示IPC+ISCH组AI低于ISCH组及IPC+ISCH+LY组（p<0.05），ISCH组与IPC+ISCH+LY组AI无差别（p>0.05）。IPC+ISCH组p-Akt、p-Bad、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6高于CON组及ISCH组（p<0.05）；ISCH组p-Akt、p-GSK-3β、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6与LY+IPC+ISCH组相比无差别（p>0.05）；IPC+ISCH组活化Caspase-3水平低于ISCH组及LY+IPC+ISCH（p>0.05），LY+IPC+ISCH组与ISCH组无差别（p>0.05）。结论欣母沛能有效诱导子宫收缩而缺血建立小鼠子宫IPC模型；IPC促进正常非缺血内膜腹腔种植；IPC减少缺血内膜细胞凋亡，促进缺血内膜腹腔种植存活；IPC通过激活Akt信号通路，磷酸化其下游底物Bad、GSK-3β，抑制凋亡执行分子Caspase-3活性，最终抑制缺血内膜细胞凋亡；通过磷酸化mTOR及其下游底物4EBP1、S6，促进缺血内膜细胞的生存。
【作者】任琼珍；
【导师】田野；钱志红；朱维培；
【作者基本信息】苏州大学，临床医学（专业学位），2014，博士
【关键词】子内膜异位症；内膜数量；注射次数；成模率；存活率；子宫内膜；缺血；凋亡；内膜存活率；缺血预处理；机制；Akt通路；

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