顶空—固相微萃取气相色谱/质谱法鉴定樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）

【摘要】樟疫霉（Phytophthoracinnamomi）是森林病害防治的重要病原菌之一，其在全球范围内造成严重的经济、社会和环境影响，已威胁到自然生态系统及生物多样性。针对樟疫霉尚缺乏有效的根除办法，目前的研究主要集中在预防及控制樟疫霉病原体的传播方面。樟疫霉早期侵染检测是预防及控制樟疫霉传播的前提，寻求樟疫霉快速可靠的检测方法体系已成为防控工作的基础和热点。微生物挥发性有机化合物具有种属及生长阶段特异性，这些物质与病原菌侵染宿主植物，在植物组织内定殖和发展密不可分。本论文以樟疫霉挥发性有机化合物为研究对象，对挥发性有机化合物作为鉴定樟疫霉的特异性生物指标进行了分析研究，建立了检测樟疫霉挥发性有机化合物的方法体系，并分析了该方法体系的可行性及灵敏性，研究了该方法体系的实际应用，鉴定了樟疫霉物种特异性挥发性有机化合物。研究得到如下结果：1.樟疫霉生长速率及形态学观察结果显示，樟疫霉菌株生长速率和形态学特性均受其生长环境影响。15oC条件下，生长在V8A上的樟疫霉菌株平均生长速率为5.6mm/d，生长在PDA上的樟疫霉菌株平均生长速率为1.7mm/d；25oC条件下，相应培养基上樟疫霉菌株平均生长速率分别为15.4mm/d和8.7mm/d，V8A培养基上各菌株间生长速率差异明显（p<0.05），A2交配型菌株生长速率大于A1交配型菌株；25oC条件下，V8A上各菌株菌落形态没有明显差异，均呈较为稀疏的辐射状气生菌丝，菌丝直而长，分枝少；而在PDA培养基上，樟疫霉菌株菌落形态各异，有呈辐射状、明显星状、繁茂的菊花状，菌丝浓密，菌丝短分枝多，具有大量菌丝膨大体，多为珊瑚状。樟疫霉各菌株厚垣孢子均呈球状，但直径差异明显，菌株均形成无乳突孢子囊，但与A2交配型相比，A1交配型有较大厚垣孢子且孢子囊有较大的纵横向比（L:B）。2.建立了分析樟疫霉挥发性有机化合物的顶空-固相微萃取气相色谱化学方法体系。选择不同的毛细色谱柱及六种不同类型的固相微萃取纤维头对樟疫霉挥发性有机化合物的萃取时间、热解析时间和解吸温度进行了优化。结果表明：50/30mDVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头于25oC顶空萃取16h，为樟疫霉挥发性有机物最佳萃取条件；在优化的固相微萃取条件下，樟疫霉挥发性有机物最佳热解吸条件是在250oC下解吸5min，被解吸下来的挥发性有机物在极性毛细色谱柱（ZB-WAXplus）上呈现较好分离效果。与传统顶空萃取方法比较，顶空-固相微萃取方法的灵敏性为传统方法的104倍。3.采用优化的顶空-固相微萃取气相色谱技术，对六种疫霉属代表种和一种腐霉属菌种挥发性有机物进行了分析比较。不同病原菌挥发性有机化合物存在很大差异，各病原菌挥发性有机化合物组成均显示种族特异性色谱图；樟疫霉种内各菌株间挥发性有机化合物气相色谱谱图保持一致，且樟疫霉菌株挥发性有机化合物特异性色谱图不受外界条件影响。樟疫霉所释放的特异性有机挥发物随其生长周期的变化而改变，表明其挥发性有机化合物色谱谱图具有生长周期特异性。4.采用优化的顶空-固相微萃取气相色谱技术对15组自然染病土中的樟疫霉进行了分析鉴定。结果显示，三组新鲜土样可直接用此方法鉴定为樟疫霉阳性，顶空-固相微萃取气相色谱法对15组供试样品中樟疫霉的总检测效率为100%，表明顶空-固相微萃取气相色谱技术对于自然环境中樟疫霉检测具有高度敏感性，不仅可用作樟疫霉定性检测，亦可对其进行定量分析。5.利用优化的顶空-固相微萃取技术收集樟疫霉侵染的羽扇豆幼苗不同侵染阶段（28-44，52-68和76-92HAI）及相应对照样品的挥发性有机化合物，并进行气相色谱分析，评估樟疫霉侵染的羽扇豆幼苗组和对照组之间的色谱差异。结果显示，从第二个取样时间段开始（52-68HAI）便可以检测到两种樟疫霉特异性挥发性有机物，羽扇豆幼苗受侵76h后可以检测到第三种樟疫霉特异性挥发性有机物，而此时受樟疫霉侵染的羽扇豆幼苗尚未观察到明显的侵染症状，表明该检测技术可应用于受樟疫霉侵染植物的早期诊断。6.利用气相色谱-质谱（GC/MS）技术分析了5种樟疫霉侵染样品（V8A，PDA，羽扇豆幼苗，河砂及种植羽扇豆幼苗的河砂）及相应对照所释放的挥发性有机物。结果显示，被检测出的总挥发性有机化合物为87种，其中4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙基苯酚、丁内酯、苯乙醇和3-羟基-2-丁酮为樟疫霉的特异性挥发性有机物，可作为检测樟疫霉的生物标记物；糠醛、苯甲醛及苯乙醛只能在对照样品中检测得到，为樟疫霉生长代谢所需物质。本研究通过系统的方法分析，建立了针对环境中樟疫霉检测的方法体系，与现行方法相比，具有快速、灵敏及经济等优点。通过对樟疫霉产生的特异性挥发物的确证，不仅对于开发樟疫霉早期预警传感器具有重要意义，而且预示着樟疫霉可以作为生产4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基苯酚的潜在自然资源。本研究为揭示樟疫霉代谢途径、樟疫霉侵染机制、樟疫霉与寄主植物互作及樟疫霉的有效防治技术奠定了必要的理论基础。本论文研究结果丰富了对利用挥发性有机化合物检测病原菌过程及其机理的认识，为进一步开展土壤及植物病害/病原菌检测研究提供了必要的科学依据。
【作者】邱睿；
【导师】曲东；任永林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，环境科学，2014，博士
【关键词】樟疫霉；检测方法；固相微萃取；气相色谱；质谱；

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