SREBPs调控牛前体脂肪细胞与成纤维细胞脂质代谢的研究

【摘要】固醇调节元件结合蛋白(Sterolregμlatoryelementbindingproteins：SREBPs)是一种膜结合蛋白，是脂肪酸和胆固醇合成过程中一些关键酶基因的主要激活剂，在维持动物细胞脂质稳态方面发挥着重要的作用。目前，关于SREBPs在调控前体脂肪细胞分化与成纤维细胞向脂肪样细胞转分化过程的机制研究的还不是很清楚，为了探索其在细胞分化过程中的作用，本研究以SREBPs家族中的SREBP1和SREBP2为研究对象，以分离的牛的原代前体脂肪细胞和原代成纤维细胞为研究媒介，应用腺病毒介导的基因沉默与基因过量表达技术，探讨SREBP1和SREBP2这两个基因在调控牛前体脂肪细胞分化与成纤维细胞转分化中的作用。同时，在mRNA水平上检测这两个基因之间的相互作用关系以及对一些在脂质代谢过程中起重要作用基因的表达规律的影响。主要研究结果如下：（1）成功克隆了秦川牛SREBP1和SREBP2基因CDS区序列全长，核酸序列长度依次为3441bp和3423bp，分别编码1146和1140个氨基酸残基；（2）筛选得到一条靶向SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053，并将其与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组，得到病毒重组子pAd-1053；构建了表达秦川牛SREBP1和SREBP2基因的穿梭载体，穿梭载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在E.coliBJ5183大肠杆菌中同源重组，得到病毒重组子pAd-SREBP1和pAd-SREBP2；将上述病毒重组子在HEK293A细胞系中包装病毒，并增值扩繁为高滴度病毒，用绿色荧光蛋白标记法测定病毒滴度，测定结果显示：干扰部分病毒Ad-1053和Ad-U6-NC(阴性对照病毒)的滴度分别是7×108和9×108GFU/mL，过表达部分病毒Ad-SREBP1、Ad-SREBP2和Ad-CMV-NC(空病毒)的滴度依次为1.5×109、7×108和1.3×109GFU/mL；（3）SREBPs能够促进细胞脂滴的积累。油红O染色结果显示，在前体脂肪细胞与成纤维细胞中单独或组合过表达SREBP1和SREBP2，能促进细胞中脂滴的积累，明显促进了前体脂肪细胞的分化和成功诱导了成纤维细胞向脂肪样细胞的转分化；干扰沉默SREBP1基因后，前体脂肪细胞中脂滴的含量显著降低，成纤维细胞中脂滴含量有些微升高的现象；干扰沉默SREBP1基因同时过表达SREBP2基因则显著提高了成纤维细胞中脂滴的含量；（4）RT-PCR结果显示，SREBPs基因家族之间存在显著的相互促进作用关系，在前体脂肪细胞与成纤维细胞中过表达或沉默SREBP1基因，能够相应促进或抑制SREBP2基因的表达，过表达SREBP2基因后同样显著提高了SREBP1基因的表达量；（5）SREBPs对一些脂质代谢相关基因的调控。结果显示在前体脂肪细胞与成纤维细胞中过表达SREBP1或SREBP2基因，显著促进了硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）、脂肪酸合酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶α（ACCα）、脂蛋白酯酶（LPL）、脂肪酸结合蛋白-3（FABP3）和脂素1(LPIN1)基因的表达；干扰沉默SREBP1后，在一定程度上又抑制了这些基因的表达；SREBP1基因对脂肪酸转运蛋白-1（FATP1）基因表达的影响只在处理细胞的前期，没有发现SREBP2基因对FATP1的显著影响；没有发现SREBPs对脂肪酸结合蛋白-4（FABP4）基因表达规律的显著影响；（6）过表达SREBPs对PPARγ和C/EBPα表达规律没有发现显著影响，干扰沉默SREBP1基因后在前期能够显著抑制PPARγ与C/EBPα的表达。综上所述，本文应用腺病毒介导的基因过表达与干扰沉默技术，探讨了SREBP1和SREBP2基因在调控牛前体脂肪细胞分化与成纤维细胞向脂肪样细胞转分化中的作用；还探讨了两者之间在转录水平上的相互作用关系，以及对一些在脂质代谢过程中发挥重要作用的功能基因转录水平的影响，为探明前体细胞分化与成纤维细胞转分化的过程提供了一定的理论依据，也为研究牛体内脂肪组织的形成与沉积机制奠定了基础。
【作者】付常振；
【导师】昝林森；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物学，2014，博士
【关键词】SREBPs基因；脂肪细胞；成纤维细胞；细胞分化；重组腺病毒；

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