华山松大小蠹肠道微生物群落多样性与幼虫肠道纤维素降解菌的研究

【摘要】华山松大小蠹（DendroctonusarmandiTaiandLi）作为中国秦岭巴山地区最为重要的森林害虫，严重危害森林健康和生态系统的稳定性。目前对其肠道微生物的群落结构和多样性知之甚少，本研究结合巢式PCR-DGGE、克隆测序、ARDRA、SDS-PAGE和native-PAGE技术对华山松大小蠹肠道微生物群落结构和多样性，以及幼虫肠道纤维素降解菌进行了系统的研究，主要研究结果如下：1.利用巢式PCR-DGGE技术分析了华山松大小蠹幼虫、蛹、雌雄成虫消化道内细菌的群落结构、多样性及其动态变化。结果表明：华山松大小蠹肠道微生物群落结构相对简单且随着发育阶段不同而发生改变，雌雄成虫的细菌群落组成差异不显著（p>0.05）；柠檬酸杆菌（Citrobacter）是华山松大小蠹幼虫、雌雄成虫肠道细菌群落的主要组分，尤其是在雌性成虫肠道细菌群落中更显优势，占细菌群落总数的80%，而蛹期甲基杆菌（Methylobacterium）占细菌群落总数的56%，为优势种群。基于Citrobacter的固氮性和Methylobacterium参与碳循环等，可以推测华山松大小蠹肠道细菌与华山松大小蠹的发育和营养利用密切相关。2.利用真菌18SrRNA区域PCR扩增与DGGE技术研究了华山松大小蠹坑道、幼虫、蛹、雌雄成虫消化道内的真菌群落。结果表明：华山松大小蠹不同发育期肠道内的真菌群落多样性指数均表现出显著差异（p<0.05）；酵母菌中的假丝酵母（Candida）是华山松大小蠹坑道、幼虫、蛹和雌雄成虫期的优势种群，尤其是在蛹期肠道真菌群落组成中更为明显，占真菌群落总数的56%，而华山松大小蠹共生蓝变真菌（长喙壳属Ophiostoma）则是华山松大小蠹坑道、幼虫、蛹和雌雄成虫期丝状真菌群落组成的最高组分。华山松大小蠹的肠道真菌大多与其消化活动、解毒作用以及信息素合成相关。3.通过以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源和干果红染色法，从华山松大小蠹幼虫肠道中筛选出91株纤维素降解细菌，通过ARDRA分型为11类，对各类细菌进行形态和分子鉴定的结果显示：幼虫肠道纤维素降解菌主要是由γ-变形菌纲（73.6%）、α-变形菌纲（8.8%）和厚壁菌门（17.6%）的细菌组成，其中γ-变形菌纲肠杆菌科沙雷氏菌属（Serratia）是华山松大小蠹肠道可培养细菌中最重要的纤维素降解菌，占总纤维素降解菌的49.5%，假单胞菌（Pseudomonas）占总纤维素降解菌的22%。本研究首次发现短波杆菌（Brevundimonaskwangchunensis）、泡囊短波单胞菌（B.vesicularis）、甲基杆菌（M.populi）和假黄色单胞菌（Pseudoxanthomonasmexicana）具有纤维素降解活性。4.通过形态和分子鉴定，证实了华山松大小蠹幼虫肠道纤维素降解真菌即为华山松大小蠹体外共生真菌秦岭细粘束孢（Leptographiumqinlingensis），表明华山松大小蠹幼虫肠道的秦岭细粘束孢由成虫体外携带，经幼虫取食而进入肠道。5.通过硫酸铵分级沉淀和DEAE-纤维素阴离子交换柱纯化得到秦岭细粘束孢的漆酶蛋白，在SDS-PAGE和native-PAGE图谱中仅显示一个条带，为单一蛋白，分子量61kDa，米氏常数15.3M，最大反应速度372.9U/mg。此外，1mM和10mM的Cl-、SO42-、NO3-对秦岭细粘束孢的漆酶活性影响不显著（p>0.05），而100mM的Cl-和NO3-离子对漆酶活性具有显著的抑制作用（p<0.05）。本试验对华山松大小蠹各发育阶段肠道微生物的丰度、种群结构、群落功能多样性等方面的研究丰富了华山松大小蠹肠道微生态、华山松大小蠹与微生物的内在关系，有助于进一步探索肠道微生物对华山松大小蠹的营养消化、发育和解毒机制的影响，并为华山松大小蠹的种群动态和纤维素的营养利用，及其综合治理提供了理论依据。
【作者】胡霞；
【导师】陈辉；
【作者基本信息】西北农林科技大学，野生动植物保护与利用，2014，博士
【关键词】华山松大小蠹；微生物群落；巢式PCR-DGGE；纤维素酶；漆酶；

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