黄芪多糖及其硫酸化修饰产物体内外抗炎活性研究

【摘要】抗生素最开始是作为促生长添加剂使用，能显著促进动物生长，提高饲料报酬，并起到预防疾病的作用。但是伴随着抗生素在动物生产中的长期、不合理使用，越来越多的负面影响也日渐突出，如抗生素耐药性及畜产品中的残留问题等。因此，越来越多的研究开始关注抗生素替代品的开发。黄芪多糖（AstragalusPolysaccharides，APS）是中草药黄芪的重要组成成分，具有抗炎和免疫调节等生物学活性，且无残留、毒副作用小。本研究分4个试验，采用体外检测和体内验证相结合的方法，探讨APS的抗炎活性，并系统研究硫酸化修饰对APS抗炎活性的影响，以期为抗生素替代品的研发提供理论依据。试验一黄芪多糖的体外抗炎活性研究本试验采用脂多糖（LPS）刺激建立Caco2细胞体外炎症模型，研究添加方式和剂量对APS抗炎效果的影响。APS（0、25、50、100和200μg/mL）和1μg/mLLPS以下述三种方式添加：（1）治疗添加组，先用LPS刺激24h，再用APS孵育24h；（2）预防添加组，先用APS孵育24h，再用LPS刺激24h；（3）同时添加组，将LPS和APS混合后共同孵育细胞48h。用RT-qPCR方法测定炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8）和紧密连接蛋白（ZO-1和occludin）的mRNA表达，用WesternBlot方法检测紧密连接蛋白表达，用UssingChamber系统测定单层细胞短路电流（Isc）。结果显示，LPS刺激显著提高三种添加方式下Caco2细胞TNF-α、IL-1β和IL-8的mRNA表达和Isc值（P<0.05），添加100μg/mLAPS可显著降低三种炎症因子的mRNA表达和单层细胞Isc值（P<0.05）APS在治疗、预防和同时添加时的最低有效抗炎浓度分别为100、50和100μg/mL。1μg/mLLPS刺激降低预防添加组occludinmRNA的表达（P<0.05），下调了3种添加方式下ZO-1和occludin蛋白的表达；100μg/mLAPS孵育提高治疗添加组ZO-1和预防添加组occludin的mRNA和蛋白表达，提高预防添加组ZO-1的蛋白表达。研究结果表明，100μg/mLAPS孵育对LPS刺激Caco2细胞具有抗炎保护作用，且预防添加时效果更好。试验二黄芪多糖的硫酸化修饰及其细胞毒性分析功能性多糖的生物学活性与其结构有着密切的关系，本研究采用氯磺酸吡啶法对APS进行硫酸化修饰，分析硫酸化APS（SAPS）的结构特性及细胞毒性。SAPS中硫酸基的取代度（DS）根据Antonopoulos方法计算，即DS=(1.62×S%)/(32-1.02×S%)。采用AVATAR330红外光谱仪和溴化钾压片法在400-4,000cm-1范围内对SAPS进行扫描。SAPS的细胞毒性采用MTT方法测定，将1000、500、250、100、50、25和10μg/mL的SAPS添加到Caco2细胞培养基中培养24h，在570nm处测定吸光度，吸光度的大小与活细胞的数目呈正相关。结果显示，本试验中得到的SAPS的DS为1.4，红外光谱显示SAPS除了具有多糖特征性吸收峰外，在1265cm-1左右出现了一个新的吸收峰，为不对称S=O伸缩振动吸收峰，另一个新的吸收峰出现在810cm-1处，为C-O-SO3基团的对称C-O-S吸收峰，这两个特征性的吸收峰表明硫酸基已经与多糖结合成酯，即黄芪多糖硫酸酯。高浓度SAPS（250、500和1000）可显著降低Caco2细胞的OD570，具有一定的细胞毒性；但低浓度SAPS（10、25、50和100）对OD570无显著影响，不具细胞毒性，因此在后面的试验中选择25、50和100μg/mL作为SAPS添加浓度。试验三硫酸化黄芪多糖的体外抗炎活性研究本试验进一步比较SAPS和APS的体外抗炎活性。不同浓度SAPS(25、50和100μg/mL，简写为SAPS-25、SAPS-50和SAPS-100)，100μg/mLAPS（APS-100）和1μg/mLLPS按下述三种方式添加到培养基中：治疗添加组，先用LPS刺激24h，再用SAPS或APS孵育24h；预防添加组，先用SAPS或APS孵育24h，再用LPS刺激24h；同时添加组，将LPS和SAPS或APS混合后共同孵育细胞48h，以DMEM培养基作为空白对照，孵育48h，每个处理6个重复。用RT-qPCR方法检测炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8），紧密连接蛋白（ZO-1和occludin）和Toll样受体4（TLR4）的mRNA表达量，用WesternBlot方法检测紧密连接蛋白和TLR4的蛋白表达。LPS刺激提高三种添加方式下细胞炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8）和TLR4的mRNA表达（P<0.05）；降低治疗添加组和同时添加组ZO-1和occludin的mRNA表达（P<0.05），降低预防添加组ZO-1和occludin的蛋白表达。与LPS刺激组相比，100μg/mL的APS和SAPS均降低三种添加方式下细胞三种炎症因子的表达（P<0.05），SAPS-25降低治疗添加组和预防添加组三种炎症因子的表达（P<0.05）；APS-100提高三种添加方式下occludin的mRNA和蛋白表达，SAPS-100提高预防添加组ZO-1和occludin的蛋白表达，而且低浓度SAPS（25和50μg/mL）提高预防添加组ZO-1和occludin的mRNA表达（P<0.05）；添加APS和SAPS均降低TLR4的mRNA和蛋白表达，且不受添加方式和剂量的影响。结果表明，SAPS通过降低炎症因子和TLR4表达、提高紧密连接蛋白表达发挥抗炎活性，达到相同的抗炎效果所需的SAPS剂量低于APS，且预防添加时效果更好。试验四黄芪多糖和硫酸化黄芪多糖对LSP刺激肉仔鸡的抗炎及免疫调节活性研究本试验通过LPS刺激建立肉仔鸡肠道炎症模型，进一步研究APS和SAPS的体内抗炎活性与免疫调节作用。180只肉仔鸡随机分为6个处理，16-18日龄连续3天分别左侧胸肌注射生理盐水，生理盐水，APS（4、8mg/kg·BW，简写为APS-4、APS-8）和SAPS（4、8mg/kg·BW，简写为SAPS-4、SAPS-8），19和20日龄第1组注射生理盐水作为空白对照，其余5组腹腔注射1mg/kg·BWLPS。记录生长性能和免疫器官指数，测定血液指标、淋巴细胞增殖、肠道形态，用RT-qPCR方法测定炎症因子（TNF-α、IL-1β和IFN-γ）、紧密连接蛋白（ZO-2和occludin）和TLR4的mRNA表达。结果显示，LPS刺激降低肉仔鸡日增重（BWG）、采食量（FI）、空肠绒毛高度和上皮内淋巴细胞数目（P<0.05）；提高料重比（FCR）、脾脏指数、血液中异嗜细胞：淋巴细胞（H:L）比率、血浆NO浓度和T淋巴细胞上清液NO、TNOS和iNOS浓度（P<0.05）；上调了空肠IL-1β和IFN-γ的mRNA表达，下调了空肠ZO-2和occludin的mRNA表达（P<0.05）。SAPS-8提高肉仔鸡BWG和空肠绒毛高度（P<0.05），APS-8降低肉仔鸡血浆NO浓度（P<0.05）；肌注APS和SAPS均降低肉仔鸡FCR、血液中H:L比率和淋巴细胞上清液中TNOS和iNOS的浓度，并提高空肠上皮内淋巴细胞数目（P<0.05）；SAPS-4和SAPS-8降低空肠TNF-α和IL-1β的表达（P<0.05），APS-8和SAPS-8提高肉仔鸡空肠ZO-2和occludin的表达，SAPS-4降低TLR4的表达（P<0.05）。本试验结果表明，APS和SAPS对LPS刺激肉仔鸡都具有生长促进作用，这主要是通过发挥抗炎活性和一定程度的免疫调节作用实现，且同等剂量SAPS的效果优于APS。本研究表明，APS能够通过降低炎症因子表达和提高紧密连接蛋白表达来抵抗LPS的感染；APS和SAPS都具有体外的抗炎活性和体内的免疫调节、促生长活性，且在预防添加时APS和SAPS的抗炎效果较好，表明APS和SAPS可作为肉仔鸡的抗炎或者免疫调节添加剂使用；同等剂量SAPS的抗炎和免疫调节效果优于APS，表明硫酸化修饰提高APS的抗炎和免疫调节活性。
【作者】王筱霏；
【导师】姚军虎；杨小军；
【作者基本信息】西北农林科技大学，动物营养与饲料科学，2014，博士
【关键词】黄芪多糖；硫酸化黄芪多糖；抗炎活性；肉仔鸡；构效关系；

【参考文献】
[1]陈扬清.业务流程再造理论及其在税收征管中的应用[D].东北财经大学,财政学,2003,硕士.
[2]张红云,崔琪,郭春欣.输电设施可靠性统计数据自动生成系统的研发与应用[J].电力系统自动化,2005,20:101-103.
[3]李少豪.针对中小城市的交通信号控制系统的研究与设计[D].北京交通大学,2014.
[4]曲慧磊.人行天桥人致振动及舒适度评价研究[D].北京市市政工程研究院,市政工程,2014,硕士.
[5]张丽丽.数据挖掘技术的应用分析[J].山西经济管理干部学院学报,2003,04:75-76.
[6]杜晶晶.信息公开诉讼中关于“信息不存在”之探析[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[7]田福建.《农村规划导论》（第六章）翻译报告[D].四川外国语大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[8]荆海莲.高温超导块材磁体与直线三相绕组间电磁力关系[D].西南交通大学,电工理论与新技术,2013,硕士.
[9]曾龙基.室内无线定位技术的研究[D].北京交通大学,2013.
[10]贾新春,郑南宁,张元林.线性不确定时滞系统的可靠保性能鲁棒控制[J].自动化学报,2003,06:971-975.
[11]谢景新,程春田,周桂红,孙玉梅.基于经验模式分解与混沌分析的直接多步预测模型[J].自动化学报,2008,06:684-689.
[12]刘赛男.基于状态空间模型的中日航线班轮运价研究[D].大连海事大学,物流工程,2014,硕士.
[13]张瑜.发达城市生态环境指标体系的优化与评价[D].南京师范大学,环境地理学,2012,硕士.
[14]张正函.《参与（设计概要）》翻译评论[D].山东师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[15]比超.品出“螃蟹”的味道[J].中国计算机用户,2004,48:47-49.
[16]卢泽琼.动态目标特征提取与识别技术研究[D].中国科学院研究生院（光电技术研究所）,控制工程,2014,硕士.
[17]徐旻.内部审计水平与盈余质量之间的关系分析[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[18]万武南.分布式安全存储系统纠删码技术的研究[D].中国科学院研究生院（成都计算机应用研究所）,2006.
[19]何淑琴.美国农科教“三位一体”模式的引入及其影响研究[D].南京农业大学,农业推广,2011,硕士.
[20]汪津泽,赵一昕,王道喜,骆扬.大直径螺旋槽丝锥的研制[J].工具技术.2005(09)
[21]黄红艳.自拍摄影的艺术表现[D].吉林大学,艺术设计（专业学位）,2013,硕士.
[22]赵世佳,张薇薇,王曙光,肖俊平,宫晨,杜明润,姚明光,刘冰冰.氢化石墨纳米结构的合成及尺寸相关的荧光性质[J].高等学校化学学报,2014,04:711-716.
[23]吕保敬.某品牌汽车消费者对制动系统报怨行为的分类研究及营销启示[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[24]王萌.钢琴曲《夕阳箫鼓》的民族音乐特征研究[D].吉林大学,音乐,2014,硕士.
[25]陈烽.大学英语四级考试对于大学英语教学的反拨效应[D].大连海事大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[26]赵亚虹.蜡梅过氧化物酶体生成蛋白基因CpPEX22的克隆及功能初步分析[D].西南大学,细胞生物学,2013,硕士.
[27]方吉祥.城市轨道交通客流预测及运输组织方案的研究[D].北京交通大学,2007.
[28]杜珂.设备备件库存管理研究[D].湖南师范大学,应用统计学（专业学位）,2014,硕士.
[29]索南加乐,张健康,张军民,粟小华,孙成,杜斌.交直流混联系统对变压器保护性能的影响及解决措施[J].电力系统自动化,2010,03:101-106.
[30]金阳,左万利.加权Web访问模式聚类算法[J].吉林大学自然科学学报,2001,03:45-47.
[31]张睿.消防宣传视觉语言的传达与应用[D].湖北工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[32]唐佳伟.成像测井资料处理与裂缝识别方法研究[D].西安科技大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[33]刘洋.偏振控制器及其算法研究[D].浙江大学,2008.
[34]石淑青.三叶因子Ⅰ和Ⅱ在胃癌和癌前病变的表达及意义[D].浙江大学,内科学,2004,硕士.
[35]姜雅妮.论第三人侵权中的经营者安全保障义务[D].沈阳师范大学,法律,2014,硕士.
[36]李方.网页信息呈现的单页和多页的工效学研究[D].浙江理工大学,应用心理学,2013,硕士.
[37]苑敏.职业抱负对无边界职业生涯态度的影响研究[D].浙江大学,2014.
[38]张沐光,宋执环.LPMVP算法及其在故障检测中的应用[J].自动化学报,2009,06:766-772.
[39]蒋龙.砂卵石地层泥水盾构泥浆材料选择及配比优化分析[D].北京交通大学,2014.
[40]杨磊.民族地区政治发展研究[D].内蒙古大学,政治学理论,2014,硕士.
[41]姚昆.蜂蜜麻油混悬液在鼻窦内窥镜术后的应用研究[D].安徽医科大学,耳鼻咽喉科学,2004,硕士.
[42]孙艳梅.HH汽车零配件公司市场营销策略研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[43]尹济民,尹玉强.创办企业是致富奔小康的客观要求[J].农村.农业.农民.2002(11)
[44]葛丽萍.反语的语用顺应性分析[D].山西大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[45]格朝斌.衡水市新型农村合作医疗发展及效果评价研究[D].河北经贸大学,社会保障,2012,硕士.
[46]林俊龙.福建土楼整体夯土结构轴压承载力的试验研究[D].华侨大学,结构工程,2014,硕士.
[47]张睿.中国適正農業規範に関すゐ考察[D].内蒙古大学,日语语言文学,2013,硕士.
[48]郑宏,辜勇彬.用于数字化气田的智能SCADA系统[J].自动化仪表,2004,08:55-56+54.
[49]王蓉蓉.纳洛酮后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[D].山西医科大学,麻醉学（专业学位）,2013,硕士.
[50]李晓静.毒性含氧酸根离子表面印迹材料的制备及其离子识别与结合特性研究[D].中北大学,应用化学,2014,硕士.