金属铱类抗肿瘤化合物研究及转肽酶进化，非天然氨基酸修饰

【摘要】本论文主要论述了三个部分内容：1)转肽酶Sortase的进化及其在蛋白修饰上的应用；2)金属铱类抗肿瘤化合物的合成,生物评价以及机理的研究；3)基于非天然氨基酸在蛋白修饰上的应用。转肽酶A(SortaseA)是在蛋白质修饰,细胞标记上应用的有效工具之一。它能够特异性地识别蛋白中的LPETG序列,切断T残基与G残基之间的肽键,并催化T残基与N端带有寡聚甘氨酸序列的多肽或蛋白质形成新的肽键。但是较低的催化效率一直是该技术应用的瓶颈。因此,我们致力于对SortaseA进行人工进化,以期提高期催化效率。我们尝试了多种方法最终构建了基于融合荧光蛋白FRET效应的筛选系统,并优化了筛选的条件。通过易错PCR与基于蛋白结构的合理设计相结合方法构建了突变文库。经过筛选,获得了一系列的高活性突变株,并对这些突变株进行了酶学的活性测试。最终,我们通过蛋白质人工筛选进化的手段得到了反应效率约比野生型Sortase酶活性高100倍的突变株。金属药物在抗肿瘤治疗领域占据了重要的地位。自由基捕获试剂硝酮(PBN)在近期也被报道有抗肿瘤活性,我们通过设计自由基捕获试剂硝酮的前体配体与铱配合物反应,获得系列的硝酮铱氢配合物。我们测定了其体内体外抗肿瘤活性,并且对其中活性最高的化合物2f做了详细的机理考察,最后得到其与DNA相互作用,尤其是碱基A,C可能为其主要机理。扩展了铱类金属氢化合物抗肿瘤领域。基因编码非天然氨基酸引入技术是化学生物学中一项新兴技术,通过这一方法能够将一些有特殊反应活性的官能团引入蛋白中,使蛋白获得新的功能。我们合成了多种具有不同用途的非天然氨基酸,并且尝试在大肠杆菌中通过终止密码子非天然氨基酸引入技术将其特异性地引入蛋白质中的指定位点。最终,L-Thr-e-Lys和Bloc-Lys两种非天然氨基酸表现出了较高的插入效率。我们随后对含L-Thr-e-Lys的蛋白做了高碘酸氧化偶联反应。成功的将mPEG及小分子衍生物连接到蛋白上,做到了蛋白指定位点的特异性修饰。同样我们也用了thion-ene反应将巯基化合物连接到含有Bloc基团的蛋白上。这一技术可以应用于蛋白荧光标记、蛋白聚乙二醇修饰等方面,在生物学与医药领域的研究中有一定的应用价值。
【作者】宋潇达；
【导师】赵劲；
【作者基本信息】南京大学，生物学，2013，博士
【关键词】转肽酶A；蛋白进化；FRET；非天然氨基酸；高碘酸氧化；聚乙二醇修饰；生物金属化学；抗肿瘤；铱氢化物；

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