补气收涩法干预肿瘤增殖和转移的作用与机制研究

【摘要】目的：补气收涩类中药是治疗肿瘤的常用药物,其治疗作用与抑制肿瘤细胞增殖转移以及调节肿瘤血管的生成有关。补气收涩法是基于“肿瘤休眠疗法”等理念的一种中医肿瘤治法,通过固护正气、收摄癌毒,从而抑制肿瘤的增殖与转移,延长肿瘤患者的生命周期,提高患者的生存质量。本课题选择临床常用的中药黄芪和仙鹤草作为研究的对象,通过体外细胞实验研究补气收涩药对人肝癌细胞HepG2和人气静脉血管内皮细胞(HUVEC)的增殖能力、迁移能力及凋亡的影响,之后进一步检测促血管生成因子以及基质金属蛋白酶的表达的情况,初步探究补气收涩药配伍对肿瘤增殖与转移的影响及可能的作用机制,为后续研究及临床治疗用药的选择提供参考。方法：建立肝癌细胞和血管内皮细胞的体外培养的细胞模型,采用血清药理学方法,制备补气收涩药的含药血清。用MTT比色法检测补气收涩药含药血清对HepG2细胞和HUVEC增殖能力的影响,然后采用细胞侵袭实验检测其含药血清对HepG2细胞和HUVEC的侵袭及迁移能力的影响,用WesternBlot和Realtime-PCR技术检测各给药组细胞的VEGF、MMP-2和TIMP-2等重要因子的蛋白和基因表达的情况。结果：细胞实验的结果显示：课题所研究的补气收涩药对的含药血清对肝癌细胞和人脐静脉血管内皮细胞的增殖能力和迁移能力都有较为显著的影响,与空白血清组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。应用Transwell法检测各组HUVEC细胞的侵袭迁移能力,各实验组药物作用48h后,实验结果显示：不同用药组作用于HUVEC后,正置荧光显微镜下观察Transwell小室下层,透膜的细胞数目随着药物浓度的增加而减少,与空白血清对照组比较具有明显的差异,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且细胞形态也由梭形逐渐变为圆形。表明各药物组明显降低了HUVEC的侵袭力,并呈一定的剂量依赖性。应用Transwell法检测各组HepG2细胞的侵袭迁移能力,实验结果显示：各实验组药物作用48h后,正置荧光显微镜下观察Transwell小室下层,各实验组透膜的细胞数目相比较于空白血清对照组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且细胞形态也由梭形逐渐变为圆形。表明各药物组明显降低了HepG2细胞的侵袭能力,并呈一定的剂量依赖性。应用WesternBlot技术检测各组HepG2细胞的VEGF、MMP-2、TIMP-2的蛋白表达状况,实验结果显示：各实验组细胞VEGF、MMP-2的蛋白表达减少,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),各实验组细胞TIMP-2的蛋白表达增多,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。用Realtime-PCR技术检测各组HepG2细胞的MMP-2、TIMP-2的mRNA表达状况,实验结果显示：各实验组细胞MMP-2的mRNA表达减少,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),各实验组细胞TIMP-2的mRNA表达增多,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。应用WesternBlot技术检测各组HUVEC细胞的VEGF、MMP-2、TIMP-2的蛋白表达状况,实验结果显示：各实验组细胞VEGF、MMP-2的蛋白表达减少,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),各实验组细胞TIMP-2的蛋白表达增多,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。用Realtime-PCR技术检测各组HUVEC细胞的VEGF的mRNA表达状况,实验结果显示：各实验组细胞VEGF的mRNA表达减少,与空白血清组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：初步的体外细胞实验可以证实补气收涩药对人肝癌细胞HepG2的增殖能力和迁移能力具有明显的抑制作用,这可能是这些药物在细胞层面上抑制肿瘤增殖与转移的作用机制；补气收涩药降低了人肝癌细胞HepG2的MMP-2、TIMP-2、VEGF等因子的蛋白及mRNA的表达水平,这可能是这些药物在分子生物学层面上抑制肿瘤增殖与转移的作用机制。另外,补气收涩药对HUVEC细胞的增殖能力和迁移能力具有明显的抑制作用,这可能是这些药物在细胞层面上抑制血管生成的作用机制；另外,补气收涩药降低了血管内皮细胞的VEGF等因子的蛋白及mRNA的表达水平,这可能是这些药物在分子生物学层面上抑制肿瘤血管生成的作用机制。综上所述,体外实验初步表明,补气收涩法对肿瘤的增殖与转移具有抑制作用,起到抗肿瘤和抗血管生成的双重作用,更深层次的作用与机制还有待于在体实验的研究与证明。
【作者】李冰冰；
【导师】唐德才；
【作者基本信息】南京中医药大学，临床中药学，2014，博士
【关键词】补气收涩；肿瘤休眠疗法；增殖；转移；含药血清；血管内皮细胞；基质金属蛋白酶；

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