雄激素受体基因核苷酸CAG重复多态对雄激素诱导前列腺癌细胞TMPRSS2:ERG基因融合的影响

【摘要】研究背景前列腺癌是西方最常见的男性恶性肿瘤，死亡率在位于所有男性肿瘤中第二位，目前普遍认为前列腺癌是由基因、环境因素和膳食习惯共同决定，对北美移民人群研究发现，即便是在同样的环境和医疗条件下，亚洲移民和非洲及高加索移民前列腺发病率与死亡率也有显著差别，提示遗传因素在前列腺癌发生中的重要作用。雄激素在前列腺细胞的生长及前列腺肿瘤的发生、发展都起到关键作用，雄激素和雄激素受体(AR)结合形成激素-受体复合物，与AR应答基因（如PSA，TMPRSS2基因等）的启动子结合，并激活靶基因的转录。雄激素受体基因第一外显区存在核苷酸CAG重复长度多态性，正常人为8-35个CAG重复，而CAG重复长度存在显著人种差别，西班牙人后裔最长，平均23-25个CAG重复，中国人平均为22-23个CAG重复，高加索人群平均21-22个,而黑人最短，平均19-20个CAG重复。同时流行病学研究发现不同种族人群AR基因CAG重复长度分布与前列腺癌发病率呈负相关，即高前列腺癌发病率的欧美黑人后裔及高加索人平均CAG重复长度较短，而前列腺癌发病率较低的西班牙人后裔及亚洲人群平均CAG重复长度较长，所以AR基因的短CAG重复被认为可能导致AR高活性而成为前列腺癌的危险因素之一，但目前临床病例对照研究对CAG重复多态与前列腺癌易感性的关系研究结果并不一致。另一方面，研究发现雄激素作用可以使TMPRSS2和ERG基因相互靠近、共区域化，甚至发生基因融合。TMPRSS2：ERG基因融合在大约50%西方前列腺癌患者中被检测出，是人类恶性肿瘤中最常见的融合基因，中国前列腺癌患者的研究发现TMPRSS2：ERG融合基因仅约10%，中西方前列腺癌患者TMPRSS2：ERG基因融合发生率差别明显。本课题设想雄激素受体CAG重复多态性作用可能通过诱导TMPRSS2:ERG基因融合及其他基因突变来增加前列腺癌的危险，进而影响东西方人群前列腺癌的发病率差异。第一部分前列腺癌石蜡标本提取DNA并检测雄激素受体中CAG重复长度目的提取前列腺癌患者石蜡标本DNA，分析AR基因CAG重复序列长短与TMPRSS2：ERG关系，初步分析CAG的长度序列可能对TMPRSS2：ERG基因融合的影响。材料与方法苯酚-氯仿法提取126例在既往研究已经行FISH检测TMPRSS2：ERG基因融合的前列腺癌患者的石蜡标本基因组DNA。以提取基因组DNA为模板5’-ACCCAGAGGCCGCGAGCGCAG及5’-TTGCTGTTCCTCATCCAGGA为引物，对CAG重复片段进行PCR，并将PCR产物进行测序，获得每一例标本CAG重复长度。结果标本中具有17个与24个CAG重复基因多态TMPRSS2:ERG基因融合比率具有明显差异，17CAG重复多态的TMPRSS2:ERG基因融合例数阳性与阴性比为7：3，24CAGTMPRSS2:ERG基因融合阳性与阴性比为2：12（P<0.05）。结论在临床标本研究发现17个CAG重复多态的患者中TMPRSS2:ERG基因融合阳性率明显增加，而24个CAG重复多态则TMPRSS2:ERG基因融合率最低。第二部分构建不同CAG重复序列的真核表达质粒、建立表达不同CAG重复长度雄激素受体的前列腺癌细胞系目的在第一部分研究的基础上，构建出带有不同CAG重复长度多态（15CAG,17CAG和24CAG）的雄激素受体质粒，并转染入雄激素受体缺失的前列腺癌细胞系DU145。材料与方法pRR-AR-5Z质粒为模板，5’-ACGGATGCTAGCATGGAAGTTCAATTGGGTTTG;5’-TTGACTTCTAGATCACTGGGTGTGGAAATAGATG为引物，通过高保真PCR技术制备ARcDNA，将ARcDNA连接到pCR2.1TOPOT载体，转染感染态细菌，提取质粒测序证实后大量克隆具有ARcDNA的pCR2.1TOPOT载体，利用内切酶NheI及EcoRV分别内切带有ARcDNA的T载体质粒及真核生物表达质粒pcDNA3.1+，并将ARcDNA连接至pcDNA3.1+，提取质粒测序证实后大量克隆具有ARcDNA的pcDNA3.1+质粒。15,17,24个CAG重复多态患者的基因组DNA为模板，使用包含内切酶NheI端的引物5’-ACGGATGCTAGCATGGAAGTTCAATTGGGTTTG及包含及内切酶Aflii端引物5’-GCTGCTTAAGCCGGGGAAAGTGGGGCC，PCR具有不同CAG重复长度的DNA片段。连接PCR的CAG片段DNA与pCR2.1TOPOT载体，转染感受态细菌后制备大量具有CAG片段DNA与pCR2.1TOPOT载体，NheI及Aflii分别酶切前述实验所得的带有不同CAG重复序列DNA的T载体及带了AR的pcDNA3.1+载体。连接CAG重复片段和酶切后的pcDNA3.1+，转染感受态细菌后制备质粒，测序证实，获得具有不同CAG重复多态的AR的pcDNA3.1+质粒。lipofectamine2000转染携带AR基因的pcDNA3.1+质粒至AR表达缺失的前列腺癌细胞系DU145。G418筛选转染后的DU145，westernblot检测转染后的DU145雄激素受体蛋白表达，realtimePCR检测DU145雄激素受体mRNA表达。结果成功建立具有不同CAG重复长度多态雄激素受体的DU145前列腺癌细胞系。通过realtimePCR检测转染后细胞系的雄激素受体mRNA表达情况，与未转染雄激素受体的DU145细胞做比较，各细胞雄激素受体表达倍数为：阳性对照VCaP细胞为2896.3，空载体DU145为1.45，15个CAG重复多态DU145细胞为944.45,17个CAG重复多态DU145细胞为668.60，24个CAG重复多态DU145细胞为727.43。Westernblot检测转染雄激素受体的DU145细胞的雄激素受体蛋白表达情况，未能检测到明显蛋白表达。结论通过克隆及酶切技术，成功获得了具有不同CAG重复多态的雄激素受体的前列腺癌DU145细胞。第三部分FISH检测雄激素受体基因CAG重复序列与TMPRSS2:ERG基因融合关系目的用雄激素刺激具有不同CAG重复长度AR的前列腺癌细胞DU145，FISH检测不同DU145细胞的TMPRSS2:ERG共区域化发生率。材料与方法无雄激素血清培养基培养转染后的DU145细胞24小时，再用浓度100nM双氢睾酮（DHT）处理培养的细胞3小时，收集细胞后滴至载玻片，固定细胞，探针RP11-35C4(TMPRSS2红)及RP11-476D17(ERG绿)与细胞杂交，每张切片加10μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5分钟；在荧光显微镜下观察。结果将细胞用100nM双氢睾酮处理3小时后FISH检测TMPRSS2基因及ERG基因共区域化显示,雄激素处理前后基因共区域化的百分比原始DU145分别为6.95%及6.33%（P=0.083），15CAGDU145分别为6.81%及8.09%(P<0.005)，17CAGDU145分别为6.83%及10.92%(P<0.005)，24CAGDU145分别为7.21%及9.23%(P<0.005)。不表达雄激素受体的DU145用双氢睾酮处理后TMPRSS2基因及ERG基因共区域化无显著变化。而转染了雄激素受体表达质粒的质粒的雄激素处理后TMPRSS2基因及ERG基因共区域化率显著增加，其中17CAGDU145增加最为明显，高于15CAGDU145及24CAGDU145（P<0.05）。结论研究结果显示相比具有24个CAG重复多态及更短的15个CAG重复多态的细胞，具有17个CAG重复多态的前列腺癌细胞在雄激素作用下更容易诱导TMPRSS2基因和ERG基因融合。全文总结通过临床标本DNA分析及体外细胞试验，我们发现雄激素受体基因CAG重复多态与前列腺癌发生危险性可能与单纯的CAG重复长短无关，而雄激素受体基因中17个CAG重复多态可能通过增加TMPRSS2基因和ERG基因融合几率，进而增加前列腺癌的遗传易感性。
【作者】李杰；
【导师】任国胜；吕永杰；
【作者基本信息】重庆医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】前列腺癌；雄激素受体；CAG重复多态性；基因融合；基因共区域化；遗传易感性；

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