Plic-1在癫痫发生发展中的作用及其机制研究

【摘要】第一部分Plic-1在颞叶癫痫患者及动物模型中的表达目的：检测Plic-1在难治性颞叶癫痫患者及氯化锂-皮罗卡品癫痫大鼠脑组织中的表达及时空关系。方法：1.从课题组收集建立的难治性癫痫患者术后脑组织库中随机抽取30例作为实验组，非癫痫（年龄、性别匹配）脑外伤患者脑组织（皮质）10例作为对照组。2.成年雄性SD大鼠共24只（体重220-280g，2-3月龄）随机分为正常对照组（n=8）和癫痫实验组，实验组再分成有自发性发作（2m，n=8/组）和无自发性发作组（2m，n=8/组），实验组均予以氯化锂-匹罗卡品腹腔注射造模。3．用Westernblot检测Plic-1的表达，免疫荧光双标检测Plic-1表达部位。结果：1.颞叶癫痫患者术后脑组织及对照组脑组织中均有Plic-1表达，其中Plic-1在癫痫患者脑组织中表达较对照组明显减弱（*p＜0.01）。2.匹罗卡品诱发的癫痫大鼠模型中，有自发性发作的动物皮质Plic-1表达水平较无自发性发作及对照组明显降低（*p＜0.05）；有自发性发作动物海马中Plic-1表达水平较无自发性发作组及对照组降低（*p＜0.05）。免疫荧光双标显示Plic-1在癫痫模型海马中神经元胞浆、胞核表达，在星形胶质细胞中不表达。同时研究发现Plic-1在癫痫模型脑组织中与GABAARβ2/3亚基存在共表达。结论：我们的研究发现Plic-1在癫痫患者脑组织及慢性自发性发作的匹罗卡品癫痫大鼠脑组织中表达均降低，且Plic-1与GABAAR存在共表达，提示Plic-1可能参与了癫痫的发生发展。第二部分阻止Plic-1与GABAA受体结合多肽对两种癫痫动物模型行为学的影响目的：研究阻止Plic-1与GABAA受体结合多肽对癫痫大鼠行为学及GABAAR表达的影响。方法：1.构建多肽段PePα，通过立体定位显微注射到大鼠双侧海马CA1区，以选择性抑制Plic-1与GABAA受体结合，从而探索Plic-1对大鼠癫痫行为学的影响及GABAAR表达变化。2.成年雄性SD大鼠48只(220-280g,2-3月龄)随机分为两组，分别建立氯化锂-匹罗卡品和戊四氮动物模型，每组24只。每一种模型又分为三组：Control组（n=8）、Scrambledpeptide组（n=8）和PePαpeptide组（n=8）；分别微量注射10μl（1mg/kg）PePαpeptide溶液、Scrambledpeptide溶液或生理盐水。注射完毕后分别予氯化锂-匹罗卡品或戊四氮点燃。3.行为学评分：在氯化锂-匹罗卡品模型中分别观察发作的潜伏期和用Racine评分观察发作的严重程度。在戊四氮模型中主要观察发作潜伏期、PTZ严重程度评分、GTCs发生率。4.用免疫荧光双标检测各组海马CA1区Plic-1与GABAARβ2/3阳性细胞荧光强度及双标细胞计数差异，用Western-blot检测癫痫发作后各组海马中Plic-1及GABAARβ2/3表达差异。结果：1．研究发现在匹罗卡品动物模型中点燃动物发作潜伏期在PePαpeptide组较Control组及Scrambledpeptide组明显缩短(*P<0.01);在PePαpeptide组中发作的严重程度（Racine评分）也较其他对照组明显增高，其中以注射匹罗卡品后3个时间点（10min、20min及60min）具有统计学差异（*P<0.05）。在戊四氮模型中的行为学研究也发现癫痫动物发作潜伏期在PePαpeptide组较其他对照组明显缩短，差异有统计学意义（*P<0.05）；PePαpeptide组中严重程度PTZ评分较其他对照组更重（*P<0.05）；PePα组的GTC发作率也较其他对照组增加（*P<0.05）。2.PePαpeptide组中GABAARβ2/3阳性细胞荧光强度较Control组及Scrambledpeptide组明显减低，且有统计学差异(*P<0.05）。PePαpeptide组中Plic-1与GABAARβ2/3双标重合阳性细胞计数与Control组及Scrambledpeptide组比较无明显统计学意义（P＞0.05）。3.PePαpeptide组中GABAARβ2/3的表达水平较Control组及Scrambledpeptide组明显降低（*P<0.05），但Plic-1表达水平与两对照组间的差异在统计学上无显著意义（P＞0.05）。结论：我们的研究发现实验多肽能通过阻制Plic-1与GABAA受体结合影响癫痫的发生发展，从另一角度支持Plic-1可能参与了癫痫的发生发展。第三部分过表达Plic-1对癫痫动物行为学及GABAAR表达的影响目的：了解过表达Plic-1对实验大鼠癫痫发作行为学及GABAAR表达的影响。方法：1.构建携带有过表达Plic-1基因的慢病毒载体。2.成年雄性SD大鼠24只(220-280g,2-3月龄)随机分为Control组（n=8）、LV-GFP组（n=8）和LV-Plic-1组（n=8），分别在大鼠双侧海马CA1区微量注射20μl病毒溶液（LV-Plic-1组）或对照溶液（LV-GFP组）或生理盐水（Control组）。注射完毕后2周予以戊四氮点燃。3.行为学评分：分别观察PTZ严重程度、发作潜伏期、GTCs发作率，了解其对点燃动物行为学的影响。4.用免疫荧光检测各组间海马CA1区GABAARβ2/3阳性细胞荧光强度，用Western-blot检测癫痫发作后各组海马中Plic-1及GABAARβ2/3的表达差异。结果：1．LV-Plic-1组中严重程度PTZ评分较LV-GFP及Control对照组轻，有统计学差异（*P<0.05）。点燃动物发作潜伏期在LV-Plic-1组较其他对照组延长，但无统计学意义（P>0.05）；GTC发作率在LV-Plic-1组较其他对照组减少，也无统计学显著性（P＞0.05）。2．免疫荧光强度：LV-Plic-1组中GABAARβ2/3阳性细胞荧光强度较LV-GFP及Control对照组明显增加(*P<0.01）。3.LV-Plic-1组中Plic-1表达水平较LV-GFP及Control对照组明显增加(*P<0.05)。LV-Plic-1组中GABAARβ2/3亚基的表达也较其他对照组明显增加(*P<0.05)。结论：通过上述研究，我们认为Plic-1可能通过调节GABAAR的表达及功能影响了癫痫的发生。第四部分Plic-1对点燃动物神经元抑制功能的影响目的：探讨Plic-1对点燃动物神经元抑制功能的影响及其可能的潜在机制。方法：1.雄性SD大鼠16只（P14-P28）随机分为Scrambledpeptide+Mg-free组（n=8）和PePαpeptide+Mg-free组（n=8）,取材前不做任何干预。麻醉后直接取材制备海马脑片，无镁灌注液中构建无镁癫痫模型后将多肽抑制剂加入灌流液中，采用全细胞膜片钳检测多肽抑制剂干预Plic-1与GABAAR结合前后对海马CA1区锥体神经元抑制性突触后电流（mIPSC）的幅值、频率、衰减时间的影响。2.成年雄性SD大鼠25只(220-280g,2-3月龄)随机分为Control组（n=5）、LV-GFP组（n=5）和LV-Plic-1组（n=5），分别在大鼠双侧海马CA1区微量注射20μl病毒溶液（LV-Plic-1组）或对照溶液（LV-GFP组）或生理盐水（Control组）。注射完毕后2周予以戊四氮点燃。点燃后取材制备海马脑片，将制备好脑片放于无镁灌流液中灌流，采用全细胞膜片钳技术检测各组中海马CA1区锥体神经元抑制性突触后电流（mIPSC）的幅值、频率、衰减时间。结果：1.PePαpeptide组中海马CA1区锥体神经元抑制性突触后电流（mIPSC）总mIPSC幅值、mIPSC平均频率均较scrambledpeptide组及灌流前明显减少(*P＜0.01)；PePαpeptide组中mIPSC总衰减时间（DecayTime）较对照组及灌流前明显缩短(*P＜0.05）。3.LV-Plic-1组中海马CA1区锥体神经元抑制性突触后电流（mIPSC）总mIPSC幅值、mIPSC平均频率均较Control组及LV-GFP组明显增高（*P＜0.05）。LV-Plic-1组中mIPSC总衰减时间（DecayTime）较其他对照组显著延长(*P<0.01)。此外，该增高电流可被GABAAR特异性抑制剂Bicuculline完全抑制。结论：Plic-1抗癫痫机制可能是通过增强GABAAR介导的抑制性突触后电流增强抑制功能从而影响癫痫发生。
【作者】张玉皎；
【导师】王学峰；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】癫痫；癫痫发作；细胞骨架连接整合素相关蛋白（泛素样蛋白1）；GABAA受体；

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