精氨酸特异性单ADP核糖基转移酶1对小鼠结肠癌CT26细胞凋亡影响及其机制研究

精氨酸特异性单ADP核糖基转移酶1对小鼠结肠癌CT26细胞凋亡影响及其机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-08-30 分类:期刊论文 喜欢:2332
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【摘要】研究背景及目的:结肠癌是世界范围内最常见及对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一,具有很高的发病率和死亡率。肿瘤细胞的凋亡是其重要生物学行为。肿瘤无限制地生长、对各种抗肿瘤治疗耐受,与基因调控失常引起的凋亡异常有密切关系。精氨酸特异性单ADP核糖基转移酶1是一种重要的单ADP核糖基转移酶。被认为可能与多种细胞生物学行为存在密切的关系,但ART1与疾病的关系研究甚少。本课题组前期对ART1与结肠癌的生物学行为的关系做了一定的研究,发现ART1基因沉默与小鼠结肠癌CT26细胞的增殖、侵袭转移、分化、微血管形成均有一定的关系。然而ART1对结肠癌细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。本课题拟在前期工作基础上,以ART1-shRNA和ART1-cDNA慢病毒转染小鼠结肠癌CT26细胞,分别介导ART1基因沉默或高表达,以顺铂(CDDP)作为凋亡诱导剂,探讨ART1表达水平改变对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡的影响,并进一步探讨ART1影响CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡的相关分子机制,为ART1作为结肠癌抗肿瘤治疗的新靶点提供实验依据和理论支持。方法:本研究分为两部分进行。1、ART1对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡影响的研究(1)ART1沉默及ART1高表达慢病毒载体稳定转染CT26细胞株获取和鉴定以慢病毒介导的ART1-shRNA和ART1-cDNA分别转染小鼠结肠癌CT26细胞,同时设立空载体病毒转染对照组(LV-control组)和未转染对照组(Untransfected组)。1)荧光显微镜下观察GFP绿色荧光表达强度,对转染效果进行鉴定。2)RT-PCR方法检测各组转染CT26细胞ART1mRNA表达,从mRNA水平进行鉴定。3)WesternBlot方法检测各组转染CT26细胞ART1蛋白表达,从蛋白水平进行鉴定。(2)ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡影响的离体研究1)以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。DNALaddering观察各组CT26细胞凋亡梯状条带(Ladder)形成情况。2)以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。分别以AnnexinV-PE/7-AAD流式细胞检测和Hoechst33342凋亡细胞计数观察ART1对CDDP诱导后CT26细胞凋亡水平的影响。3)以CDDP处理后的LV-control组和Untransfected组CT26细胞为对照,ART1-shRNA组CT26细胞、ART1-cDNA组CT26细胞为实验组,CCK8细胞计数方法检测ART1对CDDP诱导后CT26细胞生存率的影响。(3)ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡影响的在体研究1)建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡,腹腔注射等体积生理盐水为对照。观察各组CT26细胞皮下移植瘤体积和重量变化,探讨ART1对CT26细胞皮下移植瘤生长的影响。2)建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡,腹腔注射等体积生理盐水为对照。WesternBlot法检测各组移植瘤细胞PARP-1裂解水平,探讨ART1对移植瘤细胞凋亡水平的影响。2、ART1影响CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡机制的研究(1)Akt、ERK细胞信号通路及NF-κB的检测1)Akt表达和活性的检测以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组CT26细胞Akt的表达和phos-AktT308的表达。2)PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞ART1、Akt表达及Akt磷酸化水平影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组,经LY294002处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot法检测各组CT26细胞ART1、Akt和phos-AktT308的表达。3)ERK表达和活性的检测以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组CT26细胞ERK和phos-ERK的表达。4)MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞ART1、ERK表达及ERK磷酸化水平影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组,经PD98059处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot检测CT26细胞ART1、ERK和phos-ERK的表达。5)核转录因子NF-κBp65表达和核转位水平的检测以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法分别检测各组CT26细胞全细胞核转录因子NF-κBp65的表达和细胞核内NF-κBp65的表达。6)PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞NF-κBp65表达影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组,经LY294002处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot检测CT26细胞全细胞NF-κBp65的表达和细胞核内NF-κBp65的表达。7)MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞NF-κBp65表达影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组,经PD98059处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot检测CT26细胞全细胞NF-κBp65的表达和细胞核内NF-κBp65的表达。(2)Bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达检测1)Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达检测以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达。2)PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组,经LY294002处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot检测CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达。3)MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组,经PD98059处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot法检测各组小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达。(3)微管蛋白TUBB3表达的检测1)CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3蛋白表达检测以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。WesternBlot法检测各组CT26细胞TUBB3蛋白的表达;同时,建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡,腹腔注射等体积生理盐水为对照。WesternBlot方法检测各组移植瘤细胞TUBB3蛋白的表达。2)CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3mRNA表达检测以CDDP作为凋亡诱导剂,分别诱导ART1-shRNA组、ART1-cDNA组、LV-control组和Untransfected组CT26细胞凋亡。未经CDDP处理的相应各组为对照。RT-PCR法检测各组细胞TUBB3mRNA的表达。同时,建立ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control和Untransfected组CT26细胞Balb/c小鼠右腋窝皮下移植瘤模型。各组小鼠腹腔注射CDDP诱导移植瘤细胞凋亡,腹腔注射等体积生理盐水为对照。RT-PCR法检测各组移植瘤细胞TUBB3mRNA的表达。3)PI3K抑制剂LY294002对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3蛋白表达影响的检测以未经LY294002处理的CT26细胞为对照组,经LY294002处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot检测各组CT26细胞TUBB3的表达。4)MEK抑制剂PD98059对CDDP诱导凋亡的小鼠结肠癌CT26细胞TUBB3蛋白表达影响的检测以未经PD98059处理的CT26细胞为对照组,经PD98059处理的CT26细胞为实验组,以CDDP诱导各组CT26细胞凋亡,WesternBlot法检测各组CT26细胞TUBB3的表达。结果:1、ART1对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡的影响(1)ART1基因沉默及高表达慢病毒转染小鼠结肠癌CT26细胞获取及鉴定荧光显微镜下观察结果显示,ART1-shRNA、ART1-cDNA或空载体慢病毒转染小鼠结肠癌CT26细胞后,均见荧光,具有荧光的细胞达70%-80%;RT-PCR结果显示,ART1-shRNA慢病毒转染CT26细胞后ART1mRNA表达较对照组显著降低(P<0.05),ART1-cDNA慢病毒转染CT26细胞后,ART1mRNA表达较对照组明显增高(P<0.05),LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较ART1mRNA表达无明显改变(P>0.05)。WesternBlot结果显示,ART1-shRNA慢病毒转染CT26细胞后ART1蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05),ART1-cDNA慢病毒转染CT26细胞后,ART1蛋白表达较对照组明显增高(P<0.05),LV-control慢病毒转染CT26细胞与UntransfectedCT26细胞比较,ART1蛋白表达无明显改变(P>0.05)。证实成功获得ART1沉默及ART1高表达小鼠结肠癌CT26细胞株,慢病毒载体对CT26细胞ART1表达无影响。(2)ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡影响的离体研究1)DNALaddering检测结果显示经CDDP处理后的ART1-shRNA、ART1-cDNA、LV-control及Untransfected组CT26细胞均可见梯状条带,CDDP未处理的各组则无梯状条带。2)AnnexinV-PE/7-AAD流式检测结果显示,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞凋亡率显著上升(P<0.05),ART1-cDNA组CT26细胞凋亡率则显著下降(P<0.05),而LV-control组CT26细胞凋亡率与Untransfected组比较无明显变化(P>0.05);未经CDDP处理的各组CT26细胞凋亡率很低,差别无统计学意义(P>0.05)。3)Hoechst33342凋亡细胞计数结果显示,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞凋亡率显著升高(P<0.05),ART1-cDNA组CT26细胞则凋亡率显著降低(P<0.05),而LV-control组CT26细胞凋亡率与Untransfected组比较,无明显变化(P>0.05)。未经CDDP处理的各组CT26细胞具凋亡特征的细胞极少,且差别无统计学意义(P>0.05)。4)CCK8检测结果显示,与LV-control组和Untransfected组CT26细胞CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞生存率明显下降(P<0.05),ART1-cDNA组CT26细胞生存率明显上升(P<0.05),LV-control组CT26细胞生存率与Untransfected组CT26细胞比较无明显变化(P>0.05);(3)ART1对CDDP诱导的CT26细胞移凋亡影响的在体研究1)在Balb/c小鼠移植瘤中,与LV-control、UntransfectedCT26细胞移植瘤比较,ART1-shRNACT26细胞移植瘤体积和重量均明显降低(P<0.05),ART1-cDNACT26细胞移植瘤体积和重量均增加(P<0.05),LV-controlCT26细胞移植瘤与UntransfectedCT26细胞移植瘤比较差异无显著性(P>0.05);2)WesternBlot对PARP-1裂解片段的检测显示,与LV-control、UntransfectedCT26细胞移植瘤比较,ART1-shRNACT26细胞移植瘤细胞凋亡率明显上升(P<0.05),而ART1-cDNACT26细胞移植瘤细胞凋亡率则下降(P<0.05),LV-controlCT26细胞移植瘤凋亡率与UntransfectedCT26细胞移植瘤比较差异无显著性(P>0.05)。2、ART1影响CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞凋亡机制的研究(1)ART1对小鼠结肠癌CT26细胞Akt、ERK表达和活性的影响1)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组、ART1-cDNA组CT26细胞Akt表达无明显改变(P>0.05);LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较Akt表达变化无明显差异(P>0.05);与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞phos-AktT308表达均明显下降(P<0.05),而ART1-cDNA组CT26细胞phos-AktT308表达均上升(P<0.05);LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较phos-AktT308表达变化无明显差异(P>0.05)。2)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较,以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞ART1、Akt表达无明显改变(P>0.05),phos-AktT308表达明显下降(P<0.05)。3)WesternBlot结果显示与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,无论有无CDDP处理,ART1-shRNA组、ART1-cDNA组CT26细胞ERK蛋白表达无明显改变(P>0.05);LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较ERK表达改变无明显差异(P>0.05)。无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞phos-ERK表达降低(P<0.05),ART1-cDNA组CT26细胞phos-ERK表达增高(P<0.05),LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较phos-ERK表达改变无明显差异(P>0.05)。4)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较,以PD98059特异性抑制ERK通路活性后的CT26细胞ART1、ERK表达无明显改变(P>0.05),phos-ERK表达明显下降(P<0.05)。5)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组、ART1-cDNA组CT26细胞全细胞NF-κBp65表达无明显改变(P>0.05);LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较全细胞NF-κBp65表达改变无明显差异(P>0.05);与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞核内NF-κBp65表达明显下降(P<0.05);ART1-cDNA组CT26细胞核内NF-κBp65表达明显上升(P<0.05)。LV-control组CT26细胞与Untransfected组比较细胞核内NF-κBp65表达改变无明显差异(P>0.05)。6)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较,以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞全细胞NF-κBp65表达无明显改变(P>0.05),细胞核内NF-κBp65表达下降(P<0.05)。7)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较,以PD98059特异性抑制ERK通路活性后的CT26细胞全细胞NF-κBp65表达无明显改变(P>0.05),细胞核内NF-κBp65表达亦无明显改变(P>0.05)。(2)ART1对小鼠结肠癌CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax表达的影响1)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl表达下降,Bax表达上升(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低;ART1-cDNA组CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl表达上升,Bax表达下降(P<0.05),Bcl-2/Bax比值增高;而LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较Bcl-2、Bcl-xl和Bax的表达均无明显改变(P>0.05)。2)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较,以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl表达明显下降(P<0.05),Bax表达明显增高(P<0.05)。3)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较,以PD98059特异性抑制ERK通路活性后CT26细胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax表达均无明显改变(P>0.05)。(3)ART1对小鼠结肠癌CT26细胞微管蛋白TUBBB3表达的影响1)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞TUBB3蛋白表达均下降(P<0.05);ART1-cDNA组CT26细胞TUBB3蛋白表达均上升(P<0.05)。而LV-control组CT26细胞与Untransfected组CT26细胞比较TUBB3蛋白表达无明显改变(P>0.05);无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞移植瘤比较,ART1-shRNA组CT26细胞移植瘤细胞TUBB3蛋白表达均下降(P<0.05);ART1-cDNA组CT26细胞移植瘤细胞TUBB3蛋白表达均上升(P<0.05)。而LV-control组CT26细胞移植瘤与Untransfected组CT26细胞移植瘤比较TUBB3蛋白表达无明显改变(P>0.05);2)PT-PCR结果显示,无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞比较,ART1-shRNA组CT26细胞TUBB3mRNA表达均明显下降(P<0.05),在ART1-cDNA组CT26细胞TUBB3mRNA则表达上升(P<0.05),LV-control组CT26细胞TUBB3mRNA表达与对照组比较无明显改变(P>0.05);无论有无CDDP处理,与LV-control组、Untransfected组CT26细胞移植瘤比较,ART1-shRNA移植瘤细胞TUBB3mRNA表达明显下降(P<0.05),ART1-cDNA移植瘤细胞TUBB3mRNA表达上升(P<0.05)。LV-control移植瘤细胞TUBB3mRNA表达与Untransfected组比较无明显改变(P>0.05)。3)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经LY294002处理对照组CT26细胞比较,以LY294002特异性抑制Akt通路活性后的CT26细胞TUBB3的表达明显下降(P<0.05)。4)WesternBlot结果显示,无论有无CDDP处理,与未经PD98059处理对照组CT26细胞比较,以PD98059特异性抑制ERK通路活性后的CT26细胞TUBB3的表达明显下降(P<0.05)。结论:1、ART1沉默显著提高CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞及Balb/c小鼠右腋窝CT26细胞皮下移植瘤细胞的凋亡水平,降低小鼠结肠癌CT26细胞生存率,抑制Balb/c小鼠右腋窝CT26细胞皮下移植瘤生长;ART1高表达则作用相反。ART1在离体或在体情况下均对CDDP诱导的小鼠结肠癌CT26细胞的凋亡具有明确影响。2、ART1沉默CT26细胞Akt活化程度下降,NF-κBp65核转位水平下降,Bcl-2、Bcl-xl表达下降,Bax表达上升,ART1高表达作用相反;特异性抑制Akt通路时NF-κBp65核转位水平下降,Bcl-2、Bcl-xl表达下降,Bax表达上升,提示ART1可通过Akt/NF-κBp65/Bcl-2、Bcl-xl、Bax途径调节CDDP诱导后CT26细胞凋亡。同时,ART1沉默CT26细胞Akt活化程度下降,可使TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降,ART1高表达作用相反,特异性抑制Akt通路时TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降,提示Akt也可通过调节TUBB3参与ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡的调节。ART1沉默CT26细胞ERK活化程度下降,NF-κBp65核转位水平下降,Bcl-2、Bcl-xl表达下降,Bax表达上升,ART1高表达作用相反,但特异性抑制ERK通路时NF-κBp65核转位水平、Bcl-2、Bcl-xl和Bax表达均无显著改变,提示ART1对CDDP诱导的CT26细胞凋亡调节也与ERK有关,ART1可通过活化ERK,调节CDDP诱导的CT26细胞凋亡,这一调节作用与NF-κBp65/Bcl-2/Bcl-xl无明显关系。此外,ART1沉默CT26细胞ERK活化程度下降,TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降,ART1高表达作用相反,特异性抑制ERK通路同样使TUBB3mRNA、TUBB3蛋白表达下降,提示ERK可通过调节TUBB3对CDDP诱导的CT26细胞凋亡发挥调节作用。ART1有可能成为潜在的协同增效的抗肿瘤治疗靶点。
【作者】肖明;
【导师】王娅兰;
【作者基本信息】重庆医科大学,组织工程与细胞工程,2014,博士
【关键词】ART1;Apoptosis;Akt;ERK;Bcl-2;TUBB3;

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