犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建

犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建

作者:师大云端图书馆 时间:2015-08-18 分类:期刊论文 喜欢:4014
师大云端图书馆

【摘要】犬瘟热(Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的犬科和其它肉食动物一种重要传染病,在全世界范围内广泛分布,常常给养犬业和毛皮动物养殖业造成严重的危害。近年来,CDV的宿主动物范围呈现逐步扩大的趋势,几乎囊括大多数肉食动物,严重影响着野生肉食动物的种群数量,引起了国内外学者的广泛关注。反向遗传操作(Reversegenetic)是20世纪90年代后期出现的新型病毒学技术,其主要是通过对病毒基因组cDNA操作而获得具有活性的病毒粒子的过程。反向遗传操作的发展和成熟,为不分节段的单股负链RNA病毒(Non-segmentsnegativestrandRNAvirus,NSNSY)的病毒学基础和应用研究提供了技术手段。采用反向遗传操作系统可对病毒基因组cDNA进行定点突变、缺失或外源基因插入修饰,从而拯救获得相应的突变、重组病毒。目前,在我国已经建立了几株CDV弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,但仍未能建立野生型强毒株的反向遗传技术平台,制约着犬瘟热病毒在宿主动物体内扩散与分布及其分子致病机制等方面的研究。因此,CDV强毒株反向遗传操作系统的建立具有重要的意义。本研究以2008年从自然感染死亡的藏獒病料中分离获得的CDV强毒株TM-CC为亲本株,进行全基因组序列测定,在此基础上构建了含有TM-CC株病毒基因组全长cDNA克隆的重组真核表达质粒pCI-CDV-TM-CC和分别表达TM-CC株病毒N、P、L蛋白基因的重组真核表达质粒pCI-CDV/NP、pCI-CDV/P和pCI-CDL/L。同时,构建了表达犬信号淋巴细胞激活因子(Signalinglymphocyteactivationmolecules,SLAM)基因的重组真核表达质粒pCAGG-dogSLAM。然后,采用磷酸钙转染的方法将上述5种质粒共转染BSR细胞,成功拯救出重组病毒,命名为rCDV-TM-CC。该重组病毒与亲本株相比,二者的生长特性基本一致,在表达犬SLAM受体的VerodogSLAM细胞上的生长曲线相似,病毒滴度达到峰值的时间相同,最高病毒滴度相近,分别为10694TCID50/mL和10678TCID50/mL。结果表明,本研究成功构建了CDV强毒株TM-CC的反向遗传操作系统,为开展犬瘟热病毒的病毒学基础研究提供了工具平台。为今后开展CDV强毒株病毒在动物机体组织中的扩散与分布和致病机制方面的研究,在重组质粒pCI-CDV-TM-CC的基础上,将增强型绿色荧光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因插入到犬瘟热病毒H和L基因之间,构成含有EGFP基因的TM-CC株病毒基因组全长cDNA克隆质粒pCI-CDV-TM-CC-EGFP,从而拯救并获得了表达EGFP基因的重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP。重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP基本保持了亲本株rCDV-TM-CC的生长特性,在VerodogSLAM细胞上的生长动力学曲线与亲本株rCDV-TM-CC基本相似,最高病毒滴度可达106.56TCID50/mL。该重组病毒在VerodogSLAM细胞上具有良好的生长特性和遗传稳定性,在VerodogSLAM细胞上连续传代20代次后,仍能稳定、高效的表达EGFP。以重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP表达的EGFP作为目的蛋白的检测方法与传统的犬瘟热病毒检测方法相比,更为敏感、特异、方便,为CDV强毒株在动物体内、外扩散及致病机制研究提供了技术手段。本研究成功建立了CDV强毒株TM-CC的反向遗传操作系统,并在此基础上成功构建了表达EGFP基因的重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP,为开展犬瘟热病毒的病毒学基础研究提供了工具平台和技术手段。另外,犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的犬科、鼬科等肉食性动物的一种急性接触性传染病,严重威胁着养犬业和皮毛动物养殖业的发展。目前我国使用的犬细小病毒病疫苗以灭活疫苗为主。然而,灭活疫苗接种动物诱导的CPV中和抗体反应持续时间较短,且生产成本较高。因此,研发更加安全、有效、成本低廉的犬细小病毒病疫苗仍具有现实意义。本研究以我国生产实践中使用的犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8为活病毒疫苗载体,在其P和M基因之间的非编码区插入CPVVP2蛋白基因,从而成功救获表达CPVVP2蛋白基因的重组CDV弱毒疫苗株rCDV/R-20/8-CPVVP2。间接免疫荧光试验和Westernblotting结果表明CPVVP2蛋白在重组病毒rCDV/R-20/8-CPVVP2感染的细胞中获得正确表达。同时,重组病毒rCDV/R-20/8-CPVVP和亲本毒株CDV/R-20/8相比,二者的生长特性基本一致,在Vero细胞的生长曲线相似,病毒滴度达到峰值的时间相同,最高病毒滴度分别可达10581TCIDso/mL和106.89TCID50/mL。该重组病毒的构建为防制犬瘟热和犬细小病毒病二联活载体疫苗的研制奠定了基础。
【作者】李维克;
【导师】夏咸柱;步志高;
【作者基本信息】东北林业大学,野生动植物保护与利用,2014,博士
【关键词】犬瘟热病毒;TM-CC强毒株;反向遗传操作;犬瘟热弱毒疫苗株;犬细小病毒;VP2蛋白;重组病毒;

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