肝再生增强因子对肾间质纤维化的作用及机制研究

肝再生增强因子对肾间质纤维化的作用及机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-08-15 分类:期刊论文 喜欢:3594
师大云端图书馆

【摘要】第一部分ALR对肾小管上皮细胞转分化的影响及机制目的:肝再生增强因子(ALR)在缺血再灌注大鼠中表现出明显的肾脏保护作用,但其是否参与肾小管上皮细胞转分化(EMT)病理过程,目前尚不清楚。本研究拟通过建立肾小管EMT细胞模型,观察ALR是否参与EMT的病理过程,并探讨外源性给予重组人ALR(rhALR)对肾小管EMT的影响及其机制。方法:建立转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管EMT细胞模型,先检测细胞内源性ALR蛋白及mRNA表达,再将细胞分为五组:①正常对照组;②单纯rhALR处理组;③单纯TGF-β1刺激组;④TGF-β1+20μg/mlrhALR处理组;⑤TGF-β1+80μg/mlrhALR处理组。酶联免疫法(ELISA)法检测培养上清液和胞质中的TGF-β1含量;蛋白免疫印迹和免疫荧光激光共聚焦检测上皮标记物E-钙粘蛋白及(肌)成纤维细胞标记物α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测细胞E-钙粘蛋白和波形蛋白mRNA水平;蛋白免疫印迹检测TGF-β1受体Ⅰ(TβRⅠ)、TGF-β1受体Ⅱ(TβRⅡ)及其下游Smads蛋白(Smad2、Smad4、Smad6、Smad7及磷酸化Smad2)、转录因子NF-κB和磷酸化NF-κB表达。结果:蛋白免疫印迹检测和实时荧光定量PCR检测显示,与正常对照组比较,TGF-β1刺激组NRK-52E细胞内源性ALR蛋白及mRNA表达显著增加(P<0.05);ELISA检测显示,与正常对照组比较,单纯ALR处理组NRK-52E细胞培养上清液和胞浆中TGF-β1的含量无显著差异(P>0.05);蛋白免疫印迹检测显示,与正常对照组比较,TGF-β1刺激组NRK-52E细胞E-钙粘蛋白表达显著下降,而波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达显著上升,有统计学意义(P<0.05);与TGF-β1刺激组比较,TGF-β1+rhALR处理组E-钙粘蛋白表达上升,而波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白表达下降,有统计学意义(P<0.05,P<0.01);蛋白免疫印迹检测显示,与正常对照组比较,单纯rhALR处理组NRK-52E细胞TβRⅡ受体表达显著下降(P<0.05),而TβR-Ⅰ受体、Smad2、Smad4、Smad6、Smad7蛋白及磷酸化Smad2、核因子NF-κB无显著差异(P>0.05);与单纯TGF-β1刺激组比较,TGF-β1+rhALR处理组细胞磷酸化Smad2和磷酸化NF-κB水平显著下降(P<0.05)。结论:ALR参与了肾小管EMT病理过程,rhALR可通过下调肾小管上皮细胞TβRⅡ受体表达、影响Smad2磷酸化水平及核因子NF-κB转录,从而抑制TGF-β1诱导的肾小管EMT。目的:我们的细胞实验结果表明,rhALR有抑制肾小管EMT的作用,那么,其是否在体内对肾间质纤维化存在影响呢?目前尚未知。本部分,拟通过建立肾间质纤维化动物模型,观察rhALR对肾间质纤维化的影响,并探讨其作用机制。方法:建立大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型,60只SPF级SD大鼠随机分为四组:①假手术组(n=15);②UUO模型组(n=15);③UUO+低剂量rhALR(100μg/kg.d)处理组(n=15);④UUO+高剂量rhALR(200μg/kg.d)处理组(n=15)。四组大鼠分别于术后第3、7、14天分批处死,留取手术侧肾脏组织。分别采用HE和Masson染色观察各实验组大鼠梗阻侧肾脏组织形态学改变;蛋白免疫印迹及免疫荧光激光共聚焦检测肾脏内源性ALR蛋白表达;蛋白免疫印迹检测肾脏组织E-钙粘蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白表达;实时荧光定量PCR检测肾脏组织波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白mRNA表达;蛋白免疫印迹检测肾脏组织TGF-β1、Smad-2、Smad-3及磷酸化Smad-2、-3蛋白表达。结果:蛋白免疫印迹及免疫荧光激光共聚焦检测显示,与假手术组比较,UUO模型组梗阻3天、7天大鼠肾脏内源性ALR表达显著增加(P<0.05),与梗阻7天比较,梗阻14天大鼠肾脏内源性ALR表达显著下降(P<0.05);与UUO模型组比较,rhALR处理组大鼠梗阻侧肾脏Masson染色纤维化评分显著降低(P<0.05,P<0.01);蛋白免疫印迹检测显示,与UUO模型组比较,rhALR处理组大鼠梗阻肾脏E-钙粘蛋白表达上升,而纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与UUO模型组比较,rhALR处理组大鼠梗阻肾脏TGF-β1表达显著下降,有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量PCR检测显示,与UUO模型组比较,rhALR处理组大鼠梗阻肾脏波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、胶原Ⅰ蛋白mRNA表达显著下调(P<0.05)。蛋白免疫印迹显示,与假手术组比较,UUO模型组大鼠梗阻侧肾脏磷酸化Smad-2和磷酸化Smad-3表达显著升高(P<0.05);与UUO模型组比较,rhALR处理组大鼠梗阻肾脏磷酸化Smad-2和磷酸化Smad-3表达显著减少(P<0.05)。结论:随着梗阻时间延长,梗阻肾脏ALR的表达呈先增加后下降的动态变化,而rhALR可通过抑制TGF-β1表达及下游信号蛋白Smad-2和Smad-3的磷酸化而显著减轻UUO大鼠梗阻肾脏间质纤维化,推测ALR可能在肾间质纤维化的病理过程中起一定作用。
【作者】陈国涛;
【导师】张玲;
【作者基本信息】重庆医科大学,内科学,2014,博士
【关键词】肝再生增强因子;上皮细胞-间充质细胞转分化;肾小管上皮细胞;转化生长因子-β1;TGF-β1受体Ⅱ;肾间质纤维化;Smads蛋白;

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