Fibulin-5对大鼠缺血再灌注脑损伤后脑水肿和轴突再生的影响及机制研究

【摘要】背景及目的急性缺血性脑卒中患者除了超早期静脉溶栓或动脉血管机械开通术可以恢复脑血流，避免脑梗死形成，保留神经功能。但多数缺血性脑卒中患者发展成为脑梗死，并且遗留神经功能障碍。缺血性脑卒中患者死亡的主要原因是脑水肿，多数缺血性脑卒中患者以抗脑水肿治疗，促进中枢神经轴突再生、神经功能恢复为该疾病主要干预手段。因为治疗脑水肿方法有限，神经元周围轴突再生抑制分子导致中枢神经系统轴突再生困难，目前缺血性脑卒中治疗方法有限。细胞外基质蛋白参与形成基底膜，调控脑组织内水平衡，细胞外基质蛋白和轴突再生抑制分子关系密切，对轴突再生抑制分子的信号传导可能有调控作用。Fibulin-5是一种细胞外基质糖蛋白，既有细胞外基质蛋白的作用，又有信号转导分子的作用。胚胎期Fibulin-5在神经管中表达丰富，发育成熟后神经系统Fibulin-5表达降低，疾病状态表达再度增高。Fibulin-5是血管再生拮抗剂，稳定基底膜，抑制血管出芽，抑制基质金属酶的产生，抑制内皮细胞间紧密连接的破坏。Fibulin-5通过RGD序列和纤连蛋白竞争性结合神经元上的整合素α5β1，过表达Fibulin-5和整合素α5β3、α5β5、α9β1结合，抑制活性氧的产生，增强神经细胞抗氧化应激的能力，耐缺血抗凋亡的能力等。缺氧刺激时Fibulin-5mRNA水平增高与Akt/mTOR信号通路密切相关。过表达Fibulin-5可能会激活Akt，p-Akt水平增高可以激活其下游信号分子GSK-3(糖原合成激酶-3)。磷酸化GSK-3可以促进微管的装配和轴突的延伸，磷酸化GSK-3可以促进缺血损伤后轴突再生。Fibulin-5广泛分布在神经元周围的细胞外间质中，参与基底膜的形成，且可能与神经轴突发育和损伤修复密切相关，目前未见此类研究的报道。本研究拟构建Fibulin-5过表达载体重组腺病毒Ad-Fbln-5，脑内皮质和海马注射转染大鼠，7天后制作脑缺血再灌注模型，探讨Fibulin-5过表达干预对局灶性脑缺血/再灌注损伤脑水肿的影响，Fibulin-5过表达是否通过抑制AQP4蛋白表达，减轻脑水肿，缩小脑梗死体积；探讨Fibulin-5过表达干预对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠的神经轴突再生，神经功能恢复的影响；Fibulin-5过表达是否增加脑缺血损伤大鼠神经元内磷酸化Akt、磷酸化GSK-3水平，抑制缺血损伤后神经细胞凋亡，促进GAP43蛋白表达，促进轴突再生和神经功能恢复。方法第一部分1.首先制作过表达载体重组腺病毒Ad-Fbln-5，30只SD大鼠，随机分为生理盐水注射组（NS组）、腺病毒Ad-Fbln-5干预组（Ad-Fbln-5组）和空载体腺病毒Ad-HK干预组，脑皮质和海马注射确定病毒转染效率，转染所用的病毒量。荧光显微镜检测明确重组腺病毒Ad-Fbln-5可以转染大鼠脑皮质和海马，转染所需的病毒滴度为9.5×1010pfu/ml，病毒滴度筛选及毒力测定见课题组程创的硕士论文。荧光定量PCR检测腺病毒Ad-Fbln-5转染大鼠后Fibulin-5mRNA水平。2.将216只成年雄性SD大鼠随机分5组，包括假手术组（Sham组），Ad-Fbln-5转染后假手术组（Ad-Fbln-5+Sham组），MCAO/再灌注组(I/R组)，重组腺病毒Ad-Fbln-5干预组（Ad-Fbln-5+I/R组），空载体重组腺病毒Ad-HK对照组（Ad+I/R组）。MCAO/再灌注组观察6个时间点，共72只大鼠，其余各组36只。转染病毒7天后，大鼠大脑中动脉被线栓阻塞，2h后拔出线栓恢复血流灌注，制作局灶性脑缺血/再灌注模型。采用干湿重法检测各组大鼠缺血损伤后3天时脑组织水含量，采用TTC染色检测3天时脑梗死体积。3.荧光定量PCR检测脑缺血损伤后1天、3天时缺血灶周围脑组织AQp4mRNA水平，Westernblot检测脑缺血损伤后3天时缺血灶周围脑组织AQP4蛋白表达，脑缺血损伤后1天时缺血灶周围脑组织VEGFα、MMP9蛋白表达。4.免疫荧光双标记检测各组大鼠脑缺血损伤后3天时，缺血灶周围脑组织AQP4在星形胶质细胞表达变化；免疫组化检测缺血损伤后1天、7天时缺血灶周围脑组织VEGFα的表达变化，进一步比较过表达Fibulin-5干预对VEGFα的表达影响。第二部分1.雄性SD大鼠168只，脑皮质和海马注射重组腺病毒Ad-Fbln-5或空载体重组腺病毒Ad-HK转染后7天，制作MCAO/再灌注模型，分组同前。Westernblot检测脑缺血损伤后Fibulin-5、GAP43、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表达变化。脑缺血损伤后3天，各组Fibulin-5、p-AKT、p-GSK-3β，GAP43蛋白表达比较。Tunel法检测脑缺血损伤后3天凋亡细胞，明确Fibulin-5和缺血后神经细胞凋亡关系。2.荧光定量PCR检测各组脑缺血损伤后3天，7天时缺血灶周围脑组织、缺血对侧半球对应部位脑组织GAP43mRNA水平比较。3.免疫荧光双标记检测Fibulin-5和MAP2，动态观察脑缺血损伤后Fibulin-5在神经元的表达变化；免疫荧光双标记动态观察Fibulin-5和GAP43表达变化，及过表达Fibulin-5干预对脑缺血损伤后GAP43表达的影响；免疫荧光双标记动态观察p-GSK-3β和GAP43表达之间的关系，Fibulin-5过表达干预对脑缺血损伤后p-GSK-3β和GAP43表达变化的影响。4.神经示踪剂BDA标记神经轴突，脑缺血损伤后7周，过表达Fibulin-5干预对由缺血对侧大脑皮层传出神经纤维发出侧枝纤维的影响，红核平面侧枝纤维跨过中线到缺血侧红核的神经纤维数进行比较，确定过表达Fibulin-5对缺血损伤后神经轴突再生的影响。5.脑缺血再灌注损伤后1天，3天，7天，2周，4周，采用改良神经功能评分标准(modifiedNeurologicalSeverityScores;mNSSscores)对各组大鼠进行神经功能缺损评分，比较过表达Fibulin-5干预对脑缺血损伤后大鼠神经功能恢复的影响。结果第一部分1.重组腺病毒Ad-Fbln-5转染大鼠后，病毒注射侧（右侧）大脑中动脉供血区脑组织Fibulin-5mRNA水平是生理盐水注射组的50倍；腺病毒Ad-Fbln-5干预组脑缺血再灌注后3天缺血侧脑组织水含量，脑梗死体积都明显低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组（P＜0.05）；2.缺血性脑损伤后1天、3天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织AQP4mRNA水平显著低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组；脑缺血再灌注后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织AQP4蛋白表达水平低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组，有显著性差异（P＜0.05）；3.脑缺血再灌注后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组星形胶质细胞AQP4表达低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组（P＜0.05）；缺血性脑损伤后1天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织VEGFα、MMP9蛋白表达低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组（P＜0.05）；脑缺血损伤后7天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围VEGFα表达和MCAO/再灌注组、空病毒Ad对照组间无明显差别。第二部分1.脑缺血损伤后缺血灶周围脑组织Fibulin-5蛋白表达逐渐增高，缺血损伤后3天Fibulin-5表达水平最高，且Fibulin-5在神经元胞体及其周围表达，星形胶质细胞及其周围未见表达；脑缺血损伤后7天，缺血灶周围脑组织表达Fibulin-5的神经元，GAP43表达也明显增多，缺血损伤后7天缺血灶周围脑组织Fibulin-5和GAP43共同表达较明显，且腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织Fibulin-5和GAP43双染阳性细胞明显多于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组，有显著性差异（P＜0.05）。2.脑缺血再灌注损伤后，缺血灶周围脑组织p-AKT、p-GSK-3β、GAP43蛋白表达开始增加，缺血损伤后3天缺血灶周围脑组织p-AKT、p-GSK-3β蛋白水平最高；脑缺血损伤后7天，缺血灶周围脑组织GAP43蛋白表达水平最高（P＜0.05）；大鼠缺血性脑损伤后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织p-AKT、p-GSK-3β和GAP43蛋白表达均高于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组；脑缺血损伤后7天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织GAP43蛋白表达高于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组。脑缺血损伤后3天，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织凋亡细胞数显著少于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组，有显著性差异（P＜0.05）。3.腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织GAP43mRNA水平在脑缺血损伤后3天明显高于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组（P＜0.05）；同时腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血对侧对应区域脑组织GAP43mRNA高于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组。缺血性脑损伤后7天时各组间GAP43mRNA水平差异和3天时一样，腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血灶周围脑组织GAP43mRNA明显高于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组，对侧也有相同趋势。4.脑缺血损伤后7周，腺病毒Ad-Fbln-5干预组红核平面缺血对侧BDA染色的神经纤维发出的侧枝形成密集的纤维网，跨过中线的纤维数明显多于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组，且缺血侧红核染色较深，表明腺病毒Ad-Fbln-5干预组缺血对侧皮层发出侧枝支配患侧红核的纤维束多于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组（P＜0.05）。5.脑缺血损伤后3天时腺病毒Ad-Fbln-5干预组mNSS评分（7.3±1.70）低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组（9.5±1.60和9.10±1.92），有显著性差异（P＜0.05），缺血后7天到4周腺病毒Ad-Fbln-5干预组mNSS评分都低于MCAO/再灌注组和空病毒Ad对照组，且差异更加明显（P＜0.05）。结论1.Fibulin-5过表达干预可以抑制脑缺血损伤后缺血灶周围脑组织AQP4蛋白表达，减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤后脑水肿程度，缩小脑梗死体积，抑制AQP4蛋白表达可能通过抑制VEGFα、MMP9等蛋白的表达而实现。2.脑缺血再灌注损伤后Fibulin-5蛋白表达逐渐升高，缺血损伤后3天，缺血灶周围脑组织Fibulin-5蛋白表达水平最高；Fibulin-5不但在血管组织表达，而且可以表达在神经元胞体及其周围，但本研究仅有组织学观察，还需要神经元细胞实验进一步验证Fibulin-5在神经元表达。3.Fibulin-5可以增加缺血灶周围神经元内p-AKt、p-GSK-3β蛋白表达水平，增强神经细胞抗凋亡能力，且Fibulin-5可以促进GAP43转录、表达。4.Fibulin-5可以促进缺血对侧皮层传出神经纤维发出侧枝延伸至患侧红核的纤维束增多，促进轴突再生；Fibulin-5可以促进缺血性脑损伤后神经功能的恢复。细胞外基质蛋白Fibulin-5可能是新的治疗脑缺血损伤的靶蛋白分子。
【作者】白永生；
【导师】秦新月；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】Fibulin-5；脑缺血/再灌注；脑水肿；水通道蛋白-4；轴突再生；

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