载笑气超声微泡造影剂显像及增效HIFU治疗骨肉瘤实验研究

【摘要】第一部分载笑气微泡造影剂的制备及性能检测目的制备一种包裹笑气的超声脂质微泡造影剂（N2O-LM），选用脂质作为外壳材料，全氟丙烷(C3F8)和笑气（N2O）为内核，检测该脂质微泡造影剂的基本特性和体内外显影效果，为后续的体内体外研究奠定基础。方法（1）采用机械振荡法制备包裹笑气的脂质微泡,以DSPC、DPPE脂质体为外壳材料，C3F8和N2O为内核；（2）造影剂制备后即刻用水复溶观察其形态，检测平均粒径及浓度，并分别于4℃冰箱放置6h、1d、3d、1w后复溶，观察其基本特性改变情况；(3)用马尔文激光检测仪检测各组微泡制备后不同时间（1d、3d、7d）的粒径大小，Zeta表面电位检测仪检测脂质微泡电位，同时各留取部分存放于4℃冰箱中，1周后再次测量其粒径、电位；（4）观察60Co辐照后，N2O-LM的形态、大小、浓度、Zeta电位的变化；（5）制备体外凝胶成像模型，观察微泡体外增强超声成像的效果，探讨其作为造影显像剂的可行性，并于体内实验观察微泡对兔肝脏显像效果，了解微泡显像的原理及能力。结果本方法成功制备载笑气脂质微泡（N2O-LM），将其封装于西林瓶中，肉眼观察其呈白色凝乳状，表面不透明且黏稠；光镜下观察：微泡数量较多、形态好，呈类圆形，大小分布较均匀，无明显聚集现象。微泡浓度约为（3.35±0.31）×109/ml，平均粒径约为（1105.7±121.2）nm，Zeta电位为（-18.7±2.65）mV。N2O-LM造影剂复溶后1d内微泡能保持较高浓度，造影剂放置3天、1周后复溶，呈白色乳液，理化性质无显著变化（P＞0.05）；60Co辐照N2O-LM后，微泡形态大小、浓度、Zeta电位无明显变化（P＞0.05）。体外超声显像示微泡呈高回声，回声强度随浓度减小而降低。结论本组实验成功制备了以DSPC、DPPE为外壳材料，全氟丙烷(C3F8)和笑气（N2O）为内核的脂质微泡造影剂，微泡形态规则、呈球形，大小及粒径较均匀，性质较稳定，浓度高，7天内理化性质无明显变化。N2O-LM具有体内外增强超声显像的能力，具备成为超声对比剂的潜能；体内实验中，N2O-LM能有效增强兔肝脏显像，对实质性脏器具有一定的应用价值，值得深入研究。第二部分N2O-LM联合聚焦超声对大鼠骨肉瘤细胞UMR-106生物学效应的研究目的探讨载笑气微泡（N2O-LM）联合聚焦超声（focusultrasound）作用于大鼠骨肉瘤细胞UMR-106所致生物学效应的机制。方法采用MTT法检测单纯超声辐照不同时间(10s、20s、30s、60s、90s)对大鼠骨肉瘤细胞UMR-106存活率的影响，以确定最佳辐照时间，聚焦超声频率为10.50MHz、声强为0.5W/cm2。将大鼠骨肉瘤细胞UMR-106悬液分为：对照组、单纯N2O组、单纯focusultrasound组、focusultrasound+C3F8-LM组、focusultrasound+N2O-LM组，N2O-LM：50ul，C3F8-LM：50ul，AnnexinⅤ/PI染色后经流式细胞计数检测其死亡方式，用MTT法检测各组细胞的存活率；结晶紫染色实验观察各处理组细胞增殖情况。选择focusultrasound参数（超声频率10.50MHz、声强：0.5W/cm2、辐照时间：20秒），采用MTT法检测聚焦超声辐照后12h、24h、36h、48h大鼠骨肉瘤细胞UMR-106的存活率，使用流式细胞仪检测细胞死亡率，hoechst33258核染色法检测细胞凋亡情况。结果聚焦超声（focusultrasound）分别辐照30s、60s及90s，对大鼠骨肉瘤细胞UMR-106的存活率有明显降低作用（P＜0.05）；当辐照时间为20s时，对UMR-106细胞存活率无明显影响（P＞0.05），为最佳辐照时间；单纯笑气对UMR-106细胞存活率无明显影响（P＞0.05）；当辐照时间为20s、N2O-LM50ul时，N2O-LM联合focusultrasound组细胞存活率明显下降（P＜0.05），AnnexinⅤ/PI染色检测显示UMR-106细胞存在坏死与凋亡，透射电镜显示超声处理后细胞胞浆内形成大小不等的空泡，核周间隙明显增大，胞膜破裂,染色质边集，并可见核碎裂及核溶解等改变。MTT检测显示focusultrasound+N2O-LM细胞存活率分别为93.18%(10s),80.28%(20s),70.68%(30s),55.38%（60s）and40.01%(90s)；focusultrasound+N2O-LM组与对照组、单纯N2O组、单纯focusultrasound组、focusultrasound+C3F8-LM组在同一时间段内比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞计数结果显示focusultrasound+N2O-LM处理组细胞死亡率与其余各组相比有显著差异（P＜0.05）；hoechst33258细胞核染色显示细胞凋亡明显增多，20%细胞出现核浓缩和絮状改变，核边集。结论N2O-LM联合focusultrasound对体外培养大鼠骨肉瘤细胞UMR-106具有显著杀伤作用，能显著抑制大鼠骨肉瘤细胞UMR-106的增殖活性，N2O可能是一种潜在的气体声敏剂，有望为骨肉瘤治疗提供新的手段。第三部分N2O-LM增效HIFU消融离体牛肝的实验研究目的观察自制N2O-LM联合HIFU消融离体牛肝效果，验证其作为HIFU增效剂的可行性，探讨N2O-LM用于HIFU增效的最适剂量及最佳辐照参数，为下一步体内增效HIFU消融肿瘤提供实验依据。并探讨N2O-LM做为HIFU增效剂的应用价值。方法取新鲜离体牛肝，局部分别注射不同比例（PBS与N2O-LM配比分别为5:1,10:1,20:1）包裹笑气的微泡造影剂，给予不同输出声功率、不同时间的HIFU辐照，通过计算辐照区灰度变化值及凝固性坏死体积评价N2O-LM联合HIFU消融效果，同时与分别注射PBS液、N2O溶液及C3F8-LM组作对照；HIFU辐照结束后，用以上评价指标评估N2O-LM的体外增效作用。结果离体牛肝组织局部注射包裹笑气的脂质微泡后经HIFU辐照，对牛肝组织有显著的消融作用，辐照区灰度变化值及凝固性坏死体积均较注射PBS液、C3F8-LM组明显增大（P<0.05）。结论N2O-LM能缩短HIFU消融时间，减小HIFU消融功率，能有效增强HIFU消融离体牛肝的生物学效应，是一种良好的HIFU增效剂。第四部分N2O-LM增效HIFU消融大鼠骨肉瘤的实验研究目的观察N2O-LM联合HIFU消融SD大鼠骨肉瘤细胞UMR-106移植瘤的抑制效应，探讨其作为HIFU增效剂的应用价值。方法进一步建立大鼠骨肉瘤细胞UMR-106的SD大鼠移植瘤模型30只，于肿瘤接种后14d，随机分为5组：A组（空白对照组），不辐照，不注射微泡亦不加笑气（N2O），B组（单纯N2O组）在辐照前经瘤内注射1ml溶于生理盐水中的笑气，C组（单纯HIFU组）行单纯HIFU辐照，D组（HIFU+C3F8-LM组）瘤内注射稀释10倍的C3F8-LM乳液1ml，E组（HIFU+N2O-LM组）注射稀释10倍的N2O-LM乳液1.0ml，以上各组注射完毕后用HIFU定点辐照，辐照声功率180W，辐照时间5s。HIFU辐照结束后，观测靶区灰度变化值及凝固性坏死体积，采集标本行HE染色，增殖细胞核抗原（PCNA）检测及透射电镜观察。处理后观察其肿瘤体积改变,观察N2O-LM对大鼠骨肉瘤细胞UMR-106实体瘤的抑制效应。石腊包埋肿瘤组织并切片,HE染色观察其形态学改变,进行免疫组化染色、分析PCNA的表达情况,探讨其抑制骨肉瘤生长的机制。结果HIFU联合载笑气脂质微泡（N2O-LM）消融大鼠骨肉瘤实验中，肿瘤消融区灰度变化值明显增加，组织凝固性坏死体积亦明显增加（P<0.05），骨肉瘤细胞PCNA阳性表达率明显降低（P<0.05）；HE染色后光镜观察，辐照区细胞结构被破坏，坏死区与周围组织分界清楚；电镜观察显示肿瘤细胞结构不清晰，细胞膜和核膜失去连续性，染色质固缩、碎裂呈团块状。HIFU+N2O-LM组与空白对照组、单纯N2O组、单纯HIFU组、HIFU+C3F8-LM组比较，肿瘤体积明显减小，差异具统计学意义﹙P＜0.05)；肿瘤组织PCNA表达下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论N2O-LM能有效增强HIFU消融SD大鼠骨肉瘤的生物学效应，是一种良好的HIFU增效剂；对大鼠骨肉瘤细胞UMR-106移植瘤增殖有显著的抑制效应，N2O-LM联合HIFU有望为临床治疗骨肉瘤开辟一条新路。
【作者】陈镜宇；
【导师】王志刚；
【作者基本信息】重庆医科大学，影像医学与核医学，2014，博士
【关键词】笑气；脂质微泡；造影剂；超声；显像；超声微泡造影剂；骨肉瘤；坏死；凋亡；高强度聚焦超声；增效剂；载笑气微泡；离体牛肝；

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