脑膜瘤浸润淋巴细胞表型及特性的研究

【摘要】目的：脑膜瘤患者的肿瘤组织中普遍存在B淋巴细胞浸润,但是到目前为止,对于这些B细胞的表型特性及其在脑膜瘤中的可能作用机制的研究有限。我们研究了来自22个脑膜瘤标本的肿瘤浸润B细胞(tumor-infiltratingBcells,TIL-Bs)的表型特征和免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)重链可变区(variableregionofheavychain,VH)的基因多态性,并分析了这些B细胞在脑膜瘤中的可能作用机制。方法：1.免疫组织化学方法初步检测脑膜瘤中是否存在B细胞浸润、B细胞分布特征和浸润程度。2.PCR扩增、质粒克隆和基因测序等分子生物学方法对294个TIL-BS、34个正常外周血初始B细胞(naiveBcells)和45个正常外周血效应/记忆B细胞(antigen-experiencedBcells)的IgVH基因进行测序,进而分析这些B细胞是否经历过特异性抗原刺激并活化等一系列过程。3.BASELINe运算法则检验TIL-BsIgVH基因的抗原选择强度。结果：1.脑膜瘤中存在数量不等的CD20+B细胞和CD138+抗体分泌浆细胞的浸润,细胞散在分布于脑膜瘤实质中,没有明显的聚集趋势,脑膜瘤微环境中未发现有利于B细胞生长、分化的特定区域。2.B细胞的浸润程度与脑膜瘤WHO等级之间不存在相关性。3.与人类B细胞IgVH等位基因(germ-linegene)相比较,每个TIL-Bs的IgVH约400个核苷酸中,平均存在19个核苷酸突变(nucleotidemutation),平均导致11个氨基酸替代(aminoacidreplacement);在阳性对照组中,外周血效应/记忆B细胞的平均核苷酸突变数为15,平均氨基酸突变数为9；与之相反,在阴性对照组中,外周血初始B细胞几乎没有核苷酸突变(平均突变数目<1)。4.我们对22个脑膜瘤标本的294个TIL-Bs的IgVH进行基因测序,其中46%的TIL-Bs属于克隆(clones)的成员,剩下的54%互不关联；每个脑膜瘤平均克隆数为3,平均每个克隆内包括6个B细胞,其中5个属于克隆变异的B细胞(variants)。正常人外周血中的效应/记忆B细胞和初始B细胞均未发现克隆现象。5.72%的TIL-Bs从IgM+转换到IgG+,67%的外周血效应/记忆B细胞从IgM+转换到IgG+,提示TIL-Bs同外周血效应/记忆B细胞一样,也经历过抗原选择过程。6.抗原选择强度检测提示在IgVH框架区(frameworkregion,FR)存在阴性选择,而在互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)存在阳性选择。结论：脑膜瘤微环境中均匀分布着数量不等的B淋巴细胞,这些B细胞中的绝大部分经历了同型转换(从IgM+到IgG+)、核苷酸超变和氨基酸替代、克隆扩增和克隆内变异的过程,提示这些B细胞是经肿瘤相关性抗原刺激后选择性表达的特异性效应/记忆B细胞。图11幅,表4个,参考文献59篇目的：T淋巴细胞在肿瘤免疫中起着关键作用,主要包括效应作用和调节作用。脑膜瘤微环境中存在T细胞浸润,但是到目前为止,关于这些T细胞的研究有限。为了探索肿瘤浸润T细胞(tumor-infiltratingTcells,TIL-Ts)在脑膜瘤中的可能作用机制,我们研究了脑膜瘤TIL-Ts的亚型和T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)beta链可变区(Vp)的基因谱,同时研究来自相同患者的外周血T细胞的相关特性并与TIL-Ts进行比较。方法：1.免疫组织化学方法初步检测脑膜瘤中是否存在T细胞浸润,并在三维空间内研究TIL-Ts的分布特点,在400倍显微镜下对这些T细胞浸润程度进行定量。2.通过流式细胞学方法检测T细胞表面及细胞内抗原,分析TIL-Ts的亚型和表达频率,并与相匹配患者外周血T细胞进行比较。3.通过流式细胞学方法检测TIL-Ts和相匹配外周血T细胞的24个TCRVp的表达情况,建立各自的TCRVβ基因谱。结果：1.脑膜瘤中存在大量CD3+T细胞浸润,浸润程度显著高于B细胞；T细胞散在分布于脑膜瘤实质中,且在脑膜瘤小血管周围的间隙里有聚集趋势。2.T细胞的浸润程度与脑膜瘤WHO等级之间不存在相关性。3.脑膜瘤患者外周血与正常人外周血中的CD4+/CD8+T细胞的分布情况相似,以CD4+为主；与之相反,TIL-Ts中仅有22%的CD4+T,大部分为具备直接杀伤功能的细胞毒性T细胞,占78%。4.在CD4+T细胞中,外周血初始T细胞的表达频率为20%,脑膜瘤中初始T细胞的表达频率为5.3%(P=0.0325)；而在效应/记忆亚类中,来自于脑膜瘤的占94%,来自于外周血的占38%(P=0.0003)。在CD8+T细胞中,外周血初始T细胞的表达频率为52%,脑膜瘤中初始T细胞的表达频率为13%(P=0.0028)；而在效应/记忆亚类中,来自于脑膜瘤的占55%,来自于外周血的占14%(P=0.0015)。由此可见,同TIL-Bs一样,大部分TIL-Ts经历过特定抗原的刺激,活化并分化成效应/记忆T细胞。5.在脑膜瘤CD4+T细胞中,平均有34%的T细胞表达PD-1,而外周血中,仅5%(P=0.0275)。在脑膜瘤Tim-3+T细胞的表达频率在脑膜瘤中(～5%)和外周血中均较低(～1%)。6.脑膜瘤中Tregs的平均表达频率为18%,相匹配的外周血中Tregs的表达频率仅为5%(P=0.0266)。7.TCRVp基因使用情况在不同患者间,同一患者的不同细胞来源(肿瘤组织和外周血),以及不同CD4+/CD8+T细胞亚型间的差别均较大,例如,在脑膜瘤032的CD8+T细胞亚群中,三个基因家族Vβ3,Vβ20和Vβ21.3选择性地表达在肿瘤微环境中；Vβ2则在外周血中过量表达,而在脑膜瘤中没有表达(P<0.05),由此可见,与匹配外周血中的T细胞相比,脑膜瘤中的T细胞经历了不同的激活和分化途径。结论：1.TIL-Ts表达抑制性表型PD-1和Tim-3,并且包括大量Tregs,可能与脑膜瘤得以发生发展相关。2.TIL-TsTCRVβ基因谱分析显示,某些亚家族会选择性高表达,而某些亚家族低表达或者完全不表达,提示脑膜瘤浸润T细胞是经肿瘤相关性抗原刺激后选择性表达的特异性效应/记忆T细胞。图7幅,表3个,参考文献58篇
【作者】方亮娟；
【导师】宋治；KevinO’Connor；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】脑膜瘤；TIL-Bs；IgV_H；克隆扩增；克隆内变异；同型转换；TIL-Ts；TCRVβ；PD-I；Tim-3；Tregs；

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